ABCA1基因启动子区域VNTR-ZNF位点多态性及与血浆HDL水平的关系

高慎霞 毛用敏 陈 倩 赵莉莉 崔让庄

血浆高密度脂蛋白（HDL）水平降低是冠心病（CHD）发生的独立危险因素之一[1]。腺苷三磷酸（ATP）结合盒转运体A1（ATP-binding cassette trans⁃porter A1，ABCA1）在启动胆固醇逆转运和HDL生成起始阶段发挥着关键作用[2]。ABCA1基因序列中某些核苷酸变异可改变其活性并影响HDL水平[3]。ABCA1基因启动子区域有多个转录因子的作用元件，其中-220 bp附近区域为ZNF202的结合位点，此处有一个同向重复序列可变数（variable number of tandem repeats，VNTR）多态位点，为ACCCC插入缺失变异（VNTR-ZNF）。本研究旨在对ABCA1基因启动子区域VNTR-ZNF位点插入/缺失多态性进行观察并探讨其与血浆HDL水平的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象 随机抽取天津市胸科医院2007年9月—2009年4月住院的心肌梗死患者（按照WHO1979年诊断标准）166例（CHD组），其中男116例，女50例，平均年龄（56.2±9.7）岁，均有持续性胸骨后剧烈疼痛，血清心肌酶升高及心电图ST-T变化。对照组99例，为同期本单位健康体检者，其中男71例，女28例，平均年龄（51.9±7.4）岁。

1.2 方法 （ 1）基因组DNA制备采用Triton低渗缓冲液溶血法从白细胞中提取。（2）PCR扩增引物参照文献设计[4]，上游引物：5′-CCC TAA GAC ACC TGC TGT ACCC-3；′下游引物：5′-CTG AGA ACC GGC TCT GTT GGT-3′。PCR（扩增体系反应体积为25 μL。各成分终浓度分别为：Tris-HCl 60 mmol/L，（NH4）2SO415 mmol/L，pH 9.5，MgCl22.5 mmol/L，脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）0.2 mmol/L，引物各0.4 μmol/L，Taq酶 2 .5 U，模板DNA 0.5 μg。循环温度：95℃5 min变性；95℃ 3 0 s、62℃ 3 0 s、72℃ 1 min，35个循环；最后72℃延伸7 min。（3）PCR扩增产物经8%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离基因型，用凝胶成像系统分析结果。（4）血脂测定：HDL及HDL亚组采用PEG20000进行沉淀去除低密度脂蛋白（LDL）和极低密度脂蛋白（VLDL），酶法测定上清液中高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平。

1.3 统计学方法 根据公式计算各等位基因频率，Har⁃dy-Weinberg公式计算各基因型（p+q=1，2pq=杂合型基因频率）的理论值（野生型：样本总数×p2；杂合突变：样本总数×2pq；纯合突变：样本总数×q2），χ2检验检测Hardy-Weinberg平衡吻合度。全部数据采用SPSS 10.0软件进行分析，计量资料数据用x ±s表示，对照组和CHD组基因型频率及等位基因频率的比较用χ2检验，不同基因型HDL水平比较用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基因型检测结果 PCR扩增出ABCA1基因启动子区域含-220 bp处ACCCC插入和缺失的基因片段，经电泳分离，插入型显示200 bp 1个条带，缺失型显示195 bp 1个条带，杂合子显示200 bp、195 bp 2个条带，见图1。

2.2 Hardy-Weinberg平衡 本研究所选人群群体代表性好（均P>0.05），能反映天津地区人群的总体情况，见表1。

表12 组ABCA1基因VNTR-ZNF位点多态基因型实际值与理论值

2.3 被检人群基因型和等位基因频率的分布状况 CHD组和对照组基因型频率和等位基因频率在2组间分布差异无统计学意义（P>0.05），见表2。被检总人群等位基因频率分别为插入型31.3%（166/530），缺失型68.7%（364/530）；基因型频率分别为插入型6.4%（17/265），缺失型43.8%（116/265），插入/缺失型49.8%（132/265）。

表2 2组基因型频率及等位基因频率分布

2.4 血浆HDL-C在不同基因型中的水平 CHD组和对照组2组内各基因型间HDL及HDL亚组分水平差异无统计学意义（P>0.05），见表3。

表3 2组不同基因型血浆HDL-C水平比较（mmol/L±s）

表3 2组不同基因型血浆HDL-C水平比较（mmol/L±s）

杂合子为插入/缺失型；均P>0.05

插入型杂合子缺失型F n 5 5 1 43 HDL 1.38±0.30 1.26±0.33 1.22±0.27 0.724 HDL2 0.51±0.17 0.49±0.22 0.49±0.19 0.038 HDL3 0.87±0.17 0.77±0.15 0.74±0.15 1.574 n 12 81 73 HDL 0.88±0.27 0.91±0.25 0.92±0.21 0.143 HDL2 0.36±0.16 0.35±0.16 0.35±0.12 0.013 HDL3 0.53±0.13 0.56±0.13 0.57±0.12 0.706对照组 CHD组基因型

3 讨论

ABCA1是参与并启动胆固醇逆向转运的重要蛋白[5]。ABCA1位于细胞膜，有2组跨膜结构，其细胞外环结构与载脂蛋白（Apo）AⅠ相连。当细胞内胆固醇增多时，高尔基体将细胞内过剩的胆固醇转到细胞膜，通过ABCA1的胞吐作用被转运到HDL中的ApoAⅠ，HDL在接受胆固醇的同时从新生的盘状转变为成熟的球状。ABCA1启动胆固醇的外流对HDL的成熟和胆固醇的逆向转运起到了重要的作用。

ABCA1基因位于9号染色体短臂，包含50个外显子和49个内含子。其开放阅读框架由6 783个核苷酸组成，编码2 261个氨基酸。在ABCA1的基因序列中存在众多的碱基变异，构成了不同的基因多态性。其中一些改变了氨基酸的组成，有些基因变异影响ABCA1的功能，使血浆中HDL水平升高或降低[6]。在ABCA1的启动子区域也存在一些基因变异，可能会影响ABCA1的转录活性，使ABCA1的生成增加或减少，从而影响胆固醇的逆转运和HDL的合成[7]。在ABCA1基因启动子-220处存在1个ACCCC插入/缺失变异，这个区域恰是转录因子ZNF 202的结合位点，而ZNF 202对ABCA1的转录起下调作用[8]。关于ACCCC插入/缺失变异是否会影响ZNF 202与其结合从而影响血浆HDL水平，目前报道很少。本研究结果显示ACCCC插入型等位基因频率为31.3%；缺失型等位基因频率为68.7%。由此产生的插入基因型频率为6.4%；缺失基因型频率为43.8%；插入/缺失基因型频率为49.8%，天津地区人群这一位点基因型的分布与Probst等[4]报道的欧洲地区人群的基因型分布有明显不同（插入型54.3%，缺失型4.4%，插入/缺失型41.3%），天津地区插入基因型频率明显低于欧洲地区，缺失基因型频率明显高于欧洲地区，提示这一位点基因变异可能与地区和种族有关。

本研究显示HDL及其亚组分水平在不同基因型之间差异均无统计学意义。Probst等[4]报道高HDL（>1 000 mg/L）者中插入型占70.4%，高于低HDL（<500 mg/L）实验者（54.4%），和中间HDL[（660±140）mg/L]实验者（57.2%），但差异无统计学意义，此与本研究结果一致。电泳迁移率实验（EMSA）显示ACCCC缺失序列DNA片段与核蛋白提取物中的转录因子的结合能力强于插入序列，而ZNF 202可下调ABCA1的转录活性，故缺失基因型血浆HDL水平可能相对较低[4]。由于本研究检测的样本数较少，未发现基因型之间HDL水平的明显差异，有待进一步研究。

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[3]Soro-Paavonen A,Naukkarinen J,Lee-Rueckert M,et al.Common ABCA1 variants,HDL levels,and cellular cholesterol efflux in sub⁃jects with familial low HDL[J].J Lipid Res,2007,48(6):1409-1416.

[4]Probst MC,Thumann H,Aslanidis C,et al.Screening for functional sequence variations and mutations in ABCA1[J].Atherosclerosis,2004,175(2):269-279.

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