高效液相色谱法测定还原固精丸中马钱苷的含量

胡 敏，金 鸣，陈三理

(福建省药品检验所，福建 福州 350001)

还原固精丸由山茱萸，黄柏，知母，牡丹皮等十四味药材经一定工艺加工制成，具有滋阴，补肾，涩精之功效。方中山茱萸具有补益肝肾，涩精固脱等作用［1］。据文献报道，山茱萸中有效成分马钱苷测定的方法有高效液相色谱法［2-3］，胶束电动毛细管色谱法［4］。本文采用高效液相色谱法，对还原固精丸中山茱萸所含马钱苷进行含量测定，并进行方法学考察。

1 仪器和试药

岛津LC-2010AHT高效液相色谱系统(自动进样器﹑二级管阵列检测器﹑Solution色谱工作站);Nicolet Evolution紫外检测仪。

马钱苷对照品(批号:11640-200502，中国药品生物制品检定所);还原固精丸及还原固精丸缺山茱萸阴性样品(泉州中侨(集团)股份有限公司药业公司提供);四氢呋喃、甲醇、乙腈为色谱纯;水为超纯水;磷酸为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Welch Materials XB C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相:四氢呋喃-乙腈-甲醇-0.05%磷酸溶液(1∶6∶4∶89);检测波长:236 nm;流速:1 mL/min;进样量:10 μL。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取马钱苷对照品适量，加80%甲醇制成每1 mL含马钱苷30 μg的溶液，即得。

2.3 供试品溶液制备

取本品适量，研细，取约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，称定重量，超声处理(功率250 W，频率 40 kHz)20 min，放冷，再称定重量，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 阴性样品溶液的制备

取缺山茱萸的阴性样品适量，按供试品溶液的制备方法制备，即得。

2.5 专属性试验

分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液各10 μL，按上述色谱条件，对还原固精丸以及缺山茱萸阴性样品进行了测定，结果阴性样品在与马钱苷对照品保留时间(约20.7 min)相应处无色谱峰出现(见图1)，表明方中其他药味对供试品中马钱苷的测定无干扰。

图1 对照品(A)、样品(B)和阴性样品(C)高效液相色谱图Fig.1 The HPLC chromatograms of reference substance(A)，sample(B)and blank(C)

2.6 线性关系考察

精密称取马钱苷对照品11.13 mg，至25 mL量瓶中，加80%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为0.405 2 mg/mL的对照品储备液。分别吸取对照品储备液0.1，0.5，1，2，5 mL 至10 mL 量瓶中，加80%甲醇稀释至刻度，摇匀，制成不同浓度的对照品溶液。吸取上述各浓度溶液10 μL注入液相色谱仪中，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，相应的进样量为横坐标，绘制标准曲线，线性回归方程为:Y=164 482 6 X+5 664，r=1.000 0，表明马钱苷在0.040 52 ～4.052 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.7 精密度试验

取同一供试品溶液(批号:050501)，照上述色谱条件重复进样6次，记录马钱苷峰面积，结果RSD=0.55%。

2.8 重复性试验

取同一批还原固经丸样品(批号:050501)，按2.3方法制备6份供试品溶液，照上述色谱条件进行测定，结果马钱苷平均含量为0.773 mg/g，RSD=0.56%。

2.9 稳定性试验

取同一供试品溶液(批号:050501)，分别于供试品溶液制备完成后的0，4，8，12 h进样，测定马钱苷的峰面积。结果RSD=0.52%，表明供试品溶液中的马钱苷放置12 h内稳定。

2.10 回收率试验

取已知马钱苷含量的同一批供试品(批号:050501)适量，研细，各精密称取约0.5 g，平行9份，置具塞锥形瓶中，分别精密加入0.401 6 mg/mL马钱苷对照品溶液 0.8，1.0，1.2 mL 各 3 份，挥干溶剂，按2.3项下方法制备供试品溶液，并测定马钱苷含量，计算回收率，结果见表 1，平均回收率为101.04%，RSD(n=9)为 1.60%。

表1 回收率试验结果(n=9)Tab.1 The result of recoveries(n=9)

2.11 样品测定

取还原固精丸样品3批，照2.3项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定样品含量，结果见表2。

表2 样品测定结果(n=3)Tab.2 Determination results of sample(n=3)

3 讨论

3.1 指标成分的选择

有关山茱萸含量测定方法的研究颇多，主要是以熊果酸、齐墩果酸和马钱苷等为含量检测指标。山茱萸中熊果酸含量测定的文献报道虽比较多，但熊果酸存在于许多药材如山楂，马鞭草，车前草、紫珠，女贞子，怀牛膝等，非山茱萸的特有成分。马钱苷为山茱萸主要有效成分，测定其含量，可为山茱萸及其制剂提供质量控制的有效手段。

3.2 提取溶剂的选择

取样品1 g，3份，精密称定，分别精密加入甲醇、80%甲醇、50%甲醇25 mL，超声30 min，测定马钱苷含量。结果表明采用80%甲醇为溶剂提取最完全，故选用80%甲醇为供试品的提取溶剂。

3.3 提取时间的选择

取样品1 g，3份，精密称定，精密加入80%甲醇25 mL，超声时间分别为 20，30，40 min，其他条件相同，测定马钱苷含量。结果表明超声20 min时，供试品中的马钱苷能提取完全，故采用超声20 min。

3.4 流动相的选择

曾采用甲醇-水、乙腈-水、四氢呋喃-乙腈-甲醇-0.05%磷酸溶液等流动相系统进行色谱分析。结果以四氢呋喃-乙腈-甲醇-0.05% 磷酸溶液(1∶6∶4∶89)作为流动相能够将马钱苷峰与杂质峰较好的分离，且峰形理想。

［1］刘 洪，许惠琴.山茱萸及其主要成分的药理学研究进展［J］.南京中医药大学学报，2003，19(4):254.

［2］唐益华，肖凯华.RP-HPLC法测定浓缩六味地黄丸中马钱苷的含量［J］.中国药事，2007，21(10):834-835.

［3］张先瑞.HPLC法测定耳聋左慈丸中马钱苷的含量［J］.国际医药卫生导报，2007，13(16):113-115.

［4］赵新峰，孙 毓.胶束电动毛细管色谱法测定山茱萸中莫罗苷和番木鳖苷的含量［J］.药物分析杂志，2007，27(8):1154-1157.