SB203580对受辐射小鼠免疫细胞的影响

李德冠，王月英，王小春，王 彦，路 璐，吴红英，张 恒，张俊伶，常建辉，翟志斌，孟爱民

(北京协和医学院 中国医学科学院 放射医学研究所 天津市分子核医学重点实验室，天津 300192)

免疫系统对辐射极为敏感，故免疫系统损伤在放射疾病、辐射事故以及临床放化疗时会受到不同程度的损伤，机体免疫功能下降，造成免疫力低下，引起继发感染等。研究发现，p38 MAPK在辐射引起的细胞损伤过程中起一定的作用，抑制该通路可缓解细胞内活性氧(ROS)引起的造血干细胞衰竭［1-3］。

SB203580是广泛应用的p38 MAPK通路抑制剂，能降低细胞中p38表达水平，有效抑制p38 MAPK通路［4-5］。本实验中我们给予受照射小鼠腹腔注射p38抑制剂SB203580，观察抑制p38通路对辐射免疫损伤的影响，探讨其作为辐射防护药物的可能性。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

SB203580(美国 LB laboratory);RPMI 1640培养基、小牛血清(美国Gibco公司);倒置显微镜(日本Olympus);流式细胞仪Coulter Altra(美国Beckman);全自动血液分析仪poch-100i(日本sysmex);infinite200多功能酶标仪(瑞士 Tecan);137Cs γ射线照射源USD，Autocell 40(加拿大原子能有限公司)，剂量率0.80 Gy/min。

1.2 动物

C57BL/6纯系小鼠，雄性，体重20～22 g，购自北京维通利华实验动物中心，合格证号:SCXK(京)2008-0003。

1.3 实验方法

1.3.1 分组及给药 将C57BL/6小鼠30只，分为对照组、照射组和SB组，每组10只。对照组接受假照射，其余2组进行2Gy剂量的γ射线照射。SB组于照射后24 h开始给药，给药剂量为15 mg/kg，腹腔给药，隔日1次，共5次，对照组、照射对照组于相同时间皮下注入等量二甲亚砜(DMSO);末次给药24 h后处死小鼠，取外周血进行分型 CD4、CD8、B220检测，取骨髓细胞测定ROS。

1.3.2 白细胞计数及分类 外周血取后用K3EDTA抗凝，用血细胞计数仪检测。采用传统的显微镜分类法，取血、涂片、自然晾干，经瑞氏染色，水漂洗晾干后，每张血涂片于显微镜(油镜)观察100个白细胞，按白细胞形态学特征逐个分别计数，计算中性粒细胞、淋巴细胞所占的百分比。

1.3.3 外周血细胞分型测定 取抗凝血50 μL加入到红细胞裂解液1 mL中，剧烈震荡混匀，避光放置15 min。随后加入含1%血清的磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)1 mL，1 000 r/min 离心 5 min。洗涤两次后弃上清，用PBS 100 μL悬起细胞，再加相应抗体混匀，避光孵育15 min。最后加入PBS或者鞘液400 μL，混匀过200目滤网滤入流式管，上机检测。并用EXPO32软件进行检测与用配套的EXPO32 Analysis软件进行分析。

1.3.4 细胞内ROS的检测 无菌条件下取小鼠的单侧股骨，用PBS冲洗进行细胞计数后，调整细胞浓度为5×105/mL，装入EP管中装载探针，37℃孵育20 min，用无血清细胞培养液洗涤细胞3次，将细胞转移至黑色96孔板中，多功能酶标仪进行荧光检测。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 外周血白细胞计数及分类计数

在第10天，取血样进行检测，结果如表1所示。当小鼠受照射后，白细胞数及淋巴细胞比例显著下降，差异有统计学意义(P＜0.05)。SB组白细胞数，比对照组也显著下降(P＜0.05)，与照射组相比无显著变化。但SB组淋巴细胞比例，却显著高于照射组(P＜0.05)，与对照组相近，表明SB对淋巴细胞有一定的保护作用。

2.2 外周血淋巴细胞分型

在第10天，取血样破红后进行检测，结果如表2所示。与对照组比较，小鼠受照射后，CD4细胞比例增加、B220细胞比例下降，差异均有统计学意义(P＜0.05)，SB组CD4与B220细胞变化趋势与照射组一致，但其CD8比例却升高，均有统计学意义(P＜0.05)。

表1 SB对受照小鼠白细胞与淋巴细胞比例的影响(± s，n=10)Tab.1 The effects of SB on the white cells and lymphocyte rate in the peripheral blood(± s，n=10)

表1 SB对受照小鼠白细胞与淋巴细胞比例的影响(± s，n=10)Tab.1 The effects of SB on the white cells and lymphocyte rate in the peripheral blood(± s，n=10)

与对照组比较:1P＜0.05;与照射组比较:2P＜0.05Compared with control group:1P ＜0.05;Compared with irradiation group:2P ＜0.05

组 别 白细胞数/(109/L) 淋巴细胞比例/% 中性粒细胞比例/%对照组5.4 ±1.0 87.8 ±1.7 12.2 ±1.7照射组 2.0 ±0.61 71.4 ±5.81 28.6 ±5.81 SB 组 1.6 ±0.41 86.0 ±2.72 14.0 ±2.72

表2 小鼠淋巴细胞分型(± s，n=10)Tab.2 The lymphocyte phenotypes in different mice groups(± s，n=10)

表2 小鼠淋巴细胞分型(± s，n=10)Tab.2 The lymphocyte phenotypes in different mice groups(± s，n=10)

与对照组比较:1P＜0.05;与照射组比较:2P＜0.05Compared with control group:1P ＜0.05;Compared with irradiation group:2P ＜0.05

组 别CD4/% CD8/% B220/%对照组19.7 ±2.5 14.3 ±2.2 53.0 ±13.0照射组 26.9 ±6.11 12.0 ±0.9 24.7 ±2.01 SB 组 27.2 ±4.31 17.4 ±2.21，2 19.6 ±6.91

2.3 ROS的检测

在第10天，收集小鼠骨髓细胞，按照ROS检测试剂盒说明操作，检测结果如表3所示。与对照组相比，照射组与SB组小鼠的骨髓细胞ROS水平均明显升高(P＜0.05);而SB组的ROS水平明显低于照射组(P ＜0.05)。

表3 各组骨髓细胞ROS水平检测结果(± s，n=10)Tab.3 The detection of ROS level in bone marrow cells(± s，n=10)

表3 各组骨髓细胞ROS水平检测结果(± s，n=10)Tab.3 The detection of ROS level in bone marrow cells(± s，n=10)

与对照组比较:1P＜0.05;与照射组比较:2P＜0.05Compared with control group:1P ＜0.05;Compared with irradiation group:2P ＜0.05

组 别 ROS水平(荧光值)ROS/%对照组4 118±23 100±0.5照射组 4 942±1071 120±2.21 SB 组 4 530 ± 311，2 110 ± 3.91，2

3 讨论

丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen Activated Protein Kinase，MAPK)信号转导通路是介导细胞反应的重要信号系统，普遍存在于多种生物，包括酵母和哺乳动物细胞，是当前细胞内信号转导研究的热点。近年来p38 MAPK通路在造血免疫系统中的作用研究已逐步展开，已证实抑制p38通路激活会保护造血祖细胞功能［6］。

机体受到辐射后，骨髓细胞的增殖、分裂功能受到损伤，导致血细胞来源减少，从而引起外周血象不同程度的变化。但各类细胞寿命不同，辐射敏感性不同，其中淋巴细胞变化最为明显［7］。白细胞分类计数是血常规的一项重要内容，对临床诊断及治疗起到一定的作用。我们通过测定小鼠外周血白细胞数及淋巴细胞百分数的变化，观察了辐射及SB203580对小鼠免疫功能的影响。研究结果显示在2Gy照射后，外周血白细胞及淋巴细胞百分数与对照组相比，均呈明显减少趋势。而SB203580对外周血白细胞总数未见保护作用，对淋巴细胞有一定的保护作用。

此外，我们还用流式细胞仪测定了外周血中T细胞，B细胞亚型所占比例。结果显示在2Gy照射后，外周血中CD4阳性细胞比例比对照组有显著增加，说明2Gy照射对CD4细胞有刺激作用。SB组对CD4与B220未见明显影响。CD8阳性细胞在受照组小鼠中比例下降，表明辐射会降低小鼠的免疫保护作用［8］，而SB203580能显著提高受照小鼠中CD8细胞比例，表明抑制p38通路可增强小鼠的免疫功能。

电离辐射能诱发细胞ROS水平升高，进而导致细胞凋亡或者衰老，ROS水平升高是小鼠辐射损伤的部分原因［9］。本实验检测了骨髓细胞中ROS水平变化，发现2Gy照射后骨髓细胞ROS水平升高，而SB能够有效降低骨髓细胞 ROS水平，表明SB203580可通过降低ROS从而对小鼠的辐射损伤给予保护。

综上所述，电离辐射对小鼠外周血淋巴细胞和骨髓细胞均造成了损伤。而SB203580对辐射损伤小鼠的免疫细胞均具有一定的保护作用，尤其是能提高外周血白细胞中淋巴细胞比例，降低骨髓细胞ROS水平。本实验研究结果为p38抑制剂应用于治疗电离辐射损伤提供了实验依据。

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