锁阳中儿茶素、根皮苷的提取及含量测定

李辰，陈卫林，郭玫，邸多隆

(1. 五邑大学 分析测试中心，广东 江门 529020；2. 中国科学院兰州化学物理研究所西北特色植物资源化学重点实验室和甘肃省天然药物重点实验室，甘肃 兰州 730000；3. 甘肃中医学院，甘肃 兰州 730000）

锁阳中儿茶素、根皮苷的提取及含量测定

李辰1,2，陈卫林3，郭玫3，邸多隆2

(1. 五邑大学 分析测试中心，广东 江门 529020；2. 中国科学院兰州化学物理研究所西北特色植物资源化学重点实验室和甘肃省天然药物重点实验室，甘肃 兰州 730000；3. 甘肃中医学院，甘肃 兰州 730000）

建立了高效液相色谱―二极管阵列检测器联用测定中药锁阳中黄酮类化合物儿茶素、根皮苷的方法. 用C18反相色谱柱梯度洗脱法成功分离了二者；以儿茶素和根皮苷含量总和为指标，以物料比、提取时间和提取次数为正交试验考察因素，优化了锁阳中黄酮的提取方法，得到的最佳提取条件为：28 kHz、50 ℃条件下，以药材量7.5倍的甲醇超声提取3次，每次30 min.该方法提取效果好，精密度、准确度和稳定性较好，用于11个不同产地锁阳样品的提取和含量测定，可作为锁阳及其制品中儿茶素和根皮苷等黄酮类化合物提取、分析及质量控制的方法.

高效液相色谱；锁阳；儿茶素；根皮苷

锁阳（Cynomorium songaricum Rupr.），锁阳科植物锁阳的干燥肉质茎，一种不含叶绿素的全寄生植物，主要分布于中国西北地区，如青海、甘肃、新疆、内蒙古、宁夏等地区的半荒漠或荒漠地带. 传统中药中，锁阳性味甘温有力，有补肾阳、益精血、补血、润肠通便之功效，用于腰膝痿软、阳痿滑精、肠燥便秘[1]；现代医学证明：锁阳提取物对人免疫缺陷病毒（HIV）[2]、抗丙型肝炎病毒（HCV）[3]、人成神经细胞瘤[4]有抑制作用，还可用于治疗妇女绝经期症状[5]等. 目前，已从锁阳中分离出有机酸、酚类、甾体、脂肪酸、黄酮、三萜、氨基酸、蛋白质及多种维生素，多酚和黄酮等是锁阳的主要活性成分，儿茶素是黄酮类化合物中最重要的活性成分之一，其含量的准确测定非常重要. 目前以HPLC法同时测定锁阳中儿茶素（catechin，CA）和根皮苷（phloridzin，PH）的方法鲜有报道. 本文采用HPLC-DAD（二极管阵列检测器）法建立了同时测定锁阳提取物中儿茶素和根皮苷的方法，并应用于中国西部不同地区采集的11个锁阳样品中二者含量的分析比较.

1 仪器、材料与试剂

1.1 仪器

Agilent 1200高效液相色谱仪（美国安捷伦公司，包括G1312A二元泵、G1315B（DAD）、自动进样器和Agilent Chemstation工作站），RE-52C型旋转蒸发仪，SHZ-D（Ⅲ）循环式真空泵（巩义市英峪予华仪器厂），BT 224S电子天平（德国赛多利斯仪器公司），KQ-250DE超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）.

1.2 材料

锁阳药材分别采自甘肃敦煌、民勤、安西、河西、张掖，新疆阜康、阿克苏，青海海西州、门源，宁夏恒武，内蒙古巴盟等11个地区，经兰州大学药学院马志刚教授鉴定为锁阳科植物锁阳的干燥肉质茎，样本存放于甘肃省天然药物重点实验室.

1.3 试剂

儿茶素对照品（中国药品生物制品检定所，批号877-200001），根皮苷对照品（Sigma公司，批号083K7072），纯净水，乙腈（色谱纯，北京J&K Chemical Ltd.），甲醇（分析纯，天津化学试剂公司），枸椽酸、N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃等均为分析纯.

2 实验部分

2.1 色谱条件

色谱柱：Eclipse XDB-C18柱（4.6mm×250mm ，5μm，美国安捷伦公司）；保护柱：Eclipse XDB-C18（4.6mm×12.5mm ，5μm，美国安捷伦公司）；流动相：乙腈（P）和水（W），梯度洗脱，12% P保持不变（0～6 min），12%～30% P（6～30 min），流速1.0 mL/min；DAD检测波长280 nm；柱温：室温；进样量：10 µL. 色谱峰定性由对照品保留时间和紫外光谱图确定，峰面积外标法定量.

2.2 对照品溶液和供试品溶液制备

2.2.1 对照品溶液制备

分别精密称取儿茶素和根皮苷对照品3.10 mg和0.968 mg，以甲醇溶解并定容到5 mL的容量瓶中，二者浓度分别为0.602 mg/mL和0.194 mg/mL，作为储备液，冰箱4 ℃保存. 用前取出放至室温，再各稀释5倍，浓度分别为0.120 mg/mL和0.0387 mg/mL.

2.2.2 供试品溶液制备

精密称取晾干并粉碎的锁阳药材约2.001 5 g，加入15 mL甲醇，在28 kHz和50 ℃条件下超声提取30 min，抽滤，滤渣再加入15 mL甲醇重复提取2次，抽滤，合并3次滤液，滤渣弃去. 将滤液浓缩近干，浓缩残余物以甲醇溶解并定容至5 mL，静置过夜. 测定前取出，放至室温，取上清液，过0.45 μm滤膜后，直接进HPLC分析.

图1 儿茶素（CA）和根皮苷（PH）紫外吸收图谱

3 结果与讨论

3.1 检测波长选择

使用DAD在200～400 nm全波长扫描，监测目标化合物的最大吸收波长. 儿茶素和根皮苷的紫外吸收图谱如图1所示：儿茶素的特征吸收波长为210 nm和280 nm，根皮苷的特征吸收波长是225 nm和285 nm. 尽管二者在低波长处的吸收更大，但此处色谱背景的干扰也很大，故选择280 nm对待测成分进行同时检测.

3.2 流动相选择

由于儿茶素和根皮苷极性有差异，利用等度洗脱不能同时分离二者，故选用梯度洗脱. 比较后发现，乙腈—水梯度洗脱体系的分离效果优于甲醇—水体系. 优化后的梯度条件如下，流动相：乙腈（P）和水（W）；梯度：0～6 min保持12% P不变，6～30 min 12%P逐渐递增到30%P；流速1.0 mL/min. 在此条件下，锁阳样品中的儿茶素、根皮苷与其他干扰成分完全分离，对照品和样品的分离谱图分别如图2和图3所示.

图2 对照品色谱图

图3 样品色谱图（敦煌锁阳）

3.3 样品前处理

3.3.1 选择提取溶剂

儿茶素和根皮苷易溶于甲醇、乙醇，比较乙醇、50%甲醇和纯甲醇3种有机溶剂作提取剂对二者提取效率的影响. 经HPLC实验发现：乙醇提取物成分复杂，对儿茶素和根皮苷的分离形成干扰；50%甲醇提取液提取出了较多难溶于甲醇的粘度较大的多糖成分，干扰测定；甲醇作提取剂，既能较充分地提取出所需的黄酮成分，又能减少水溶性成分的干扰，提取液浓缩定容也容易，对HPLC测定影响也小，因此，选定甲醇为提取溶剂.

3.3.2 确定提取方法

考察回流提取法、超声提取法和索氏提取法3种提取方式，经比较发现：超声提取法儿茶素和根皮苷含量最高，且操作简便省时. 以甲醇为溶剂进行超声提取，按表1正交试验设计法考察甲醇用量（A）、提取时间（B）和提取次数（C）等影响因素，结果见表2. 以儿茶素和根皮苷提取含量总和为考察指标，表2中极差R值大小显示各因素作用主次为C＞B＞A；表3方差分析结果表明：A、B、C3种因素均无显著性意义（P＞0.05），以A2B2C3为最佳提取条件，即优化后的最佳条件为：以药材量7.5倍（mL:g）的甲醇超声提取3次，每次30 min.

在此基础上，再考察超声温度（30 ℃、40 ℃）和超声频率（20 kHz、28 kHz）对提取的影响，结果见表4：超声频率对结果影响不大，但温度影响具有显著性，温度越高越有利于提取. 通过实验发现：50 ℃提取效果更好，但为防止黄酮等有效成分在高温下发生变化，影响将来的药效学实验，最高提取温度应小于50 ℃为宜. 通过考察比较，最终确定的超声提取方法为28 kHz、50 ℃条件下，以7.5倍药材量（mL:g）的甲醇超声提取3次，每次30 min.

表1 因素水平表

表2 正交试验结果

表4 超声温度和超声频率正交试验及结果

3.4 方法学验证

3.4.1 线性方程、线性范围、相关系数和检测限

用自动进样器分别吸取0.120 mg/mL儿茶素和0.0387 mg/mL根皮苷的对照品溶液1 µL、2 µL、5 µL、10 µL、15 µL、20 µL、30 µL，依次进样，按上述色谱条件测定，以对照品进样量（µg）为横坐标、峰面积（mAU·s）为纵坐标绘制标准曲线. 结果表明：儿茶素在0.120～3.612 μg范围内线性关系良好，根皮苷在0.0194～0.774 μg范围内线性关系良好.

以3倍信噪比计算检测限，得到儿茶素和根皮苷的检测限分别为2.15 ng和0.322 ng.

3.4.2 精密度

由日内和日间精密度评价方法的重复性，分别取0.602 mg/mL儿茶素对照品和0.194 mg/mL根皮苷对照品溶液连续进样5次，测得儿茶素和根皮苷峰面积的RSD分别为2.08%和1.92%；在6 d内，每天随机对儿茶素和根皮苷的对照品溶液进样1次，2个待测物峰面积6次测定结果的RSD小于3%，说明方法精密度良好.

3.4.3 稳定性

将同一锁阳样品溶液放置于室温下，连续考察5 d，每次进样4 µL，测得样品中儿茶素和根皮苷含量的RSD小于3%，说明方法稳定性较好.

3.4.4 回收率

精密称取已知含量的锁阳样品5份，分别加入适量的对照品溶液，按2.2.2项“供试品溶液制备”方法进行样品提取制备，按2.1项“色谱条件”进行分析，测得儿茶素和根皮苷的平均回收率分别为100.5%和99.26%，平行样的RSD分别为1.87%和2.54%，说明方法准确度较高.

3.5 样品测定

精密称取11个采自中国主要不同产地的锁阳样品，按2.2.2项“供试品溶液制备”方法和2.1项“色谱条件”，以HPLC测定药材中儿茶素和根皮苷的含量，每个样品重复测定3次. 样品的典型图谱见图3，由图可知待测组分没有干扰，提取物不同组分间分辨率较好. 不同产地锁阳中2种被测物的含量由相应标准曲线计算得到，结果列于表5.

由表5可知：1）不同产地供试品中儿茶素和根皮苷含量差别较大（青海海西州锁阳儿茶素含量最高，为1.552 mg/g；内蒙古巴盟锁阳根皮苷含量最高，为0.046 mg/g），尤其儿茶素含量差别更大（0.145～1.552 mg/g）. 2）不同产地供试锁阳样品中2种待测物均以儿茶素含量为主，且儿茶素含量远高于根皮苷的含量；这一结果与Chu等[6]用毛细管电泳—安培检测器测定锁阳的结果一致（他们测得不同产地锁阳中根皮苷含量为0.011～0.038 mg/g，亦与本文测定结果相近），但Chu[6]和张思巨[7]（尤其后者）所测锁阳样品中儿茶素含量较本文所测结果高，其测定含量为分别0.251～2.319 mg/g和0.760～20.79 mg/g，这可能与药材生长环境、采集时间及药材的新鲜程度等有关，如张思巨等指出锁阳样品中儿茶素含量与药材新鲜程度有关，同一产地锁阳鲜品中儿茶素的含量约为陈品的3倍.

表5 不同产地锁阳中儿茶素和根皮苷的含量

4 结论

本文建立了HPLC梯度洗脱同时测定锁阳中2种黄酮化合物儿茶素和根皮苷的方法，该方法操作简便，精密度和准确度较高. 利用该方法测定了采自中国西部主要产区的11个锁阳样品中儿茶素和根皮苷的含量，结果儿茶素含量均显著高于根皮苷含量，并比较了其含量与文献值的差别，指出这些差别可能是由于生长环境、药材采集时间和新鲜程度等不同造成的. 该RP-HPLC梯度洗脱方法可被用作锁阳及其制品的质量控制方法.

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Extraction and Determination of (+)-Catechin and Phloridzin from Cynomorium Songaricum

LI Chen1,2, CHEN Wei-lin3, Guo Mei3, DI Duo-long2
(1. Instrumental Analysis & Research Center, Wuyi University, Jiangmen 529020, China; 2. Key Laboratory of Chemistry of Northwestern Plant Resources & Key Laboratory for Natural Medicine of Gansu Province, Lanzhou Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences, Lanzhou 730000, China; 3. Gansu College of Traditional Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China)

A method for the simultaneous determination of (+)-Catechin and Phloridzin in extracts of Cynomorium songaricum was developed using high performance liquid chromatographic (HPLC) coupled with diode array detector (DAD). A good separation was achieved by using a C18HPLC column with gradient elution. At the same time，the method for extracting flavonoids from C. songaricum was optimized using the total content of (+)-Catechin and Phloridzin as extraction index and with the ratio of material to liquid, extraction duration and extraction times as influential factors in the orthogonal experiment. The optimum extracting conditions were 7.5 times quantity of methanol to herbal material at 28 kHz and 50 ℃, extraction for three times for 30 min each time. The proposed method was used to extract and determine the two flavonoids in C. songaricum collected from different producing area. The result showed that the method was good in aspects of extraction, precision, accuracy and stability. It can provide a reference to the extraction, analysis and quality control offlavonoids in C. songaricum and its products.

high performance liquid chromatography(HPLC); Cynomorium songaricum; (+)-Catechin; Phloridzin

O657.7；R914.4

A

1006-7302（2011）01-0023-06

2010-06-30

甘肃省中医药科研课题资助项目（GZK220052015）

李辰（1976—），男，甘肃兰州人，讲师，博士，主要从事天然产物分离分析及质控方法研究.