饲料能量和维生素B6对乌鳢生长和蛋白质合成与调控的影响

吉林农业大学动物科技学院 王桂芹 李子平 牛小天

中国水产科学研究院淡水渔业研究中心 芦洪梅 韩宇田

农业部淡水鱼类遗传育种与养殖生物学重点开放实验室 赵朝阳

生长是生物体通过同化作用进行物质积累、细胞分裂或增殖的体积增大，动物真生长是结构、组织如肌肉、骨骼、器官的体积、蛋白质量的增加，所以生长多以体蛋白变化来表示（Perez，1995）。鱼类的生长实际上是通过蛋白质合成完成的，RNA/DNA与蛋白质合成、鱼类生长速度之间具有相关性，所以RNA/DNA比率能够迅速地反映鱼类当前营养状况的变化，从而在较短的时间内准确地评定饲料的营养价值。鱼类对蛋白质周转代谢受到酶、激素和基因的调控。硬骨鱼类的生长与其他脊椎动物一样，也受到脑-脑垂体-肝脏生长轴的调控。许多研究表明，饲料通过影响鱼类激素的分泌而调控生长，如饲料蛋白摄入数量和质量等（Gomez等，2004；Marti等，1996）。 但有关饲料能量和维生素B6对鱼类蛋白质合成与调控的影响报道较少（Eales等，1992）。本试验以乌鳢为试验对象，选取饲料能量和维生素B6两个重要的蛋白质代谢的调控因素，即探讨饲料能量和维生素B6分别与蛋白质的交互作用对乌鳢蛋白质合成与调控的影响，以期为进一步阐明蛋白质代谢的调控机制，为生产上优化乌鳢饲料配方，提高产量，降低成本提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 试验饲料 以鱼粉为蛋白源，以鱼油、大豆油、糊精和面粉为能源、吡哆醇盐酸盐（Sigma）为维生素B6的来源（用前进行包膜处理）、纤维素为填充物配制半精制日粮。试验日粮为由3个蛋白水平（含34.7%、38.3%和41.8%可消化蛋白）和3个能量水平（14.5、16.0 MJ和17.5 MJ的可消化能）组合而成的9种配合饲料。试验配方及其营养组成如表1所示，其中L、M和H分别表示3个蛋白质水平，数字1、2、3分别表示3个能量水平。试验二共配制成由3个蛋白水平（34.7%、38.3%和 41.8%）和 3个维生素 B6水平（6、18 mg/kg和30 mg/kg饲料）组合而成的9种配合饲料。试验配方及其组成如表2所示，其中L、M和H分别代表3个蛋白质水平，数字1、2、3分别代表3个维生素B6水平。饲料经制粒 （1.5 mm），晒干后置于-4℃冰柜中保存、备用。

1.2 饲养管理 生长试验于2008年7月25日到2008年9月23日在安西水库池塘网箱（1 m×1 m×1 m）中进行，乌鳢鱼苗购于沈阳苏家屯，饲养于土池中2个月，试验前2 w挑选规格整齐1000尾鱼置于网箱中进行驯养，期间从冰鲜杂鱼逐渐过渡到配合饲料。待全部摄食配合饲料后，试验开始前先停食24 h，称重，随后从驯养鱼中每次随机取30尾鱼，每种饲料 3个重复，每个重复放养30尾鱼，持续饲养8 w。试验开始时从驯养鱼中随机取10尾称重。试验期间记录死鱼并称重，在试验结束前停食24 h，每个重复称重，计算特定生长率。

1.3 测定指标

1.3.1 DNA、RNA含量的测定 生长试验结束后，将鱼饥饿1 d，从每个饲料组中随机取乌鳢10尾，吸干体表水分，在每尾鱼的背鳍基部取白肌和肝胰脏作为一个样品，并于-20℃保存待测。具体方法如下：

标准曲线的测定： 配制浓度为 0、5、10、15、20 μg/mL和25 μg/mL的RNA标准液，浓度为 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、10.0 μg/mL 和 15.0 μg/mL DNA标准液。分别在260 nm和265 nm处测定RNA和DNA的吸收值（OD），RNA的标准曲线：y=0.0507x+0.0054 （R2=0.9997），DNA 的标准曲线：y=0.0177x+0.0006 （R2=0.9984），x 分别为 RNA 和DNA含量（μg/mL），y为RNA或DNA的OD值。

样品中核酸的测定：取0.5000～1.0000 g鱼白肌或肝胰脏，剪碎后置于玻璃匀浆器中，加入适量冷的0.01 mol/L柠檬酸三钠匀浆，制备RNA和DNA原液。同上测定其OD值，从标准曲线查得核酸的含量并计算。

1.3.2 IGF-I的测定 生长试验结束后，从每个饲料组中随机取乌鳢10尾，MS-222（100 mg/L）麻醉，用一次性医用注射器从尾静脉取血，肝素抗凝，4℃静置 24 h后，2500 r/min离心 10 min，分离血浆，-20℃保存备用。乌鳢血浆用酸醇处理，去除结合蛋白。取40 μL血清，加入360 μL酸醇液，混均，25℃放置30 min，10000转 4℃离心20 min，取上清0.2 mL，加入0.1 mLTris混均、离心，取上清液待测。乌鳢血清IGF-I含量采用IGF-I平衡饱和竞争放射免疫分析（RIA）法进行测定，试剂盒购自中国九鼎医学生物工程有限公司（中国，天津）。用放免γ测量仪进行计数，检测范围为1.25～100 ng/mL。

表1 试验日粮组成及营养水平（干质量）

1.4 数据处理 采用SPSS 16.0软件统计分析，用Duncan’s法进行多重比较。试验数据均以平均值±标准差表示。生长、核酸含量和血中IGF-I分别进行双变量相关分析。

2 结果

2.1 饲料能量与蛋白质的交互作用对乌鳢蛋白质合成与调控的影响 蛋白质和能量对乌鳢肌肉核酸和血中IGF-1含量的影响见表3。饲料蛋白质水平极显著影响乌鳢的RNA/DNA比率 （P＜0.01），显著影响RNA含量（P＜0.05）。在同一能量水平下，乌鳢的RNA/DNA比率及RNA含量均随饲料蛋白含量先升高后下降。能量水平极显著地影响乌鳢的RNA/DNA比率及RNA含量 （P＜0.01）。在同一蛋白水平下，乌鳢的RNA/DNA比率及RNA含量均随饲料能量含量先升高后下降，蛋能比对乌鳢的RNA/DNA比率、RNA含量及DNA含量影响均不显著（P＞0.05）。饲料蛋白质和能量水平显著影响乌鳢血清IGF-I的含量（P＜0.05），IGF-I的含量均随饲料蛋白质和能量水平呈现先升高后降低的趋势。蛋能比对乌鳢的IGF-I的含量影响不显著（P＞0.05）。核酸和血清中IGF-I与生长显著相关，相关系数分别是0.943*和0.876*。

表2 试验饲料配方及其营养组成（干质量）

2.2 饲料中维生素B6与蛋白质的交互作用对乌鳢蛋白质合成与调控的影响 蛋白质与维生素B6对核酸含量和血中IGF-1的影响见表4。饲料蛋白质水平极显著影响乌鳢的RNA/DNA比率及RNA含量（P＜0.01），随着蛋白质水平的增加，乌鳢的RNA/DNA比率及RNA含量呈先升高后稳定的趋势。维生素B6极显著影响乌鳢的RNA/DNA比率及RNA含量（P＜0.01）。在低和中蛋白质水平下，随着维生素B6的添加，高剂量维生素B6组的RNA/DNA比率显著增加（P＜0.05），高蛋白组维生素B6对乌鳢的RNA/DNA比率影响不显著（P＞0.05）。在中和高蛋白水平下，随着维生素B6的添加，RNA含量有增加的趋势，但差异不显著（P＞0.05），在低蛋白组，添加高维生素B6组的RNA含量显著增加（P＜0.05），低添加量时与对照组差异不显著（P＞0.05），饲料蛋白质和维生素B6水平及其交互作用对乌鳢的DNA含量均无显著影响（P＞0.05）。饲料蛋白质水平极显著影响乌鳢血清IGF-I的含量 （P＜0.01），除H3组外IGF-I的含量均随饲料蛋白质和维生素B6含量升高而升高，维生素B6及蛋白质与维生素B6交互作用对其影响不显著。核酸和血清中IGF-I与生长呈正相关，相关系数分别为0.886*和0.834*。

3 讨论

表3 饲料能量与蛋白质的交互作用对乌鳢生长、核酸与IGF-I含量的影晌

白肌是鱼类蛋白质合成用于沉积最高的组织，是表达鱼体生长最有代表性的组织。鱼类的生长主要是通过蛋白质的合成来实现的，真核生物细胞蛋白质合成是核酸数量和活性功能的体现（Higucra等，1999）。RNA/DNA 表示核糖体的数量或蛋白质的合成潜力或RNA的转录效率，亦是衡量组织蛋白质合成能力的指标，对翘嘴鲌（王桂芹等，2008）、虹鳟（Mathers 等，1993）、大菱鲆（Imsland等，2002）的研究表明，RNA/DNA不仅与鱼体的生长有关，也与鱼类的营养状况有关。本试验表明乌鳢肌肉的RNA/DNA与其生长正相关。鱼类对蛋白质周转代谢受到脑-脑垂体-肝脏生长轴的调控，生长激素的促生长效应主要是由IGF-I介导的，IGF-I是一种广谱性促细胞分裂素，能促进鸟氨酸脱氢酶的活性及细胞内DNA、RNA和蛋白质的生物合成，最终引起细胞的增殖与分化，促进蛋白质的合成和结缔组织及骨髓的产生（Tsai等，1995）。 大西洋鲑和尖吻鲈 （Anthony等，2004）、金头鲷（Perez等，1995）血浆 IGF-I浓度变化与生长正相关，本研究也得到同样的结果。表明肌肉核酸和血清IGF-I是衡量蛋白质合成和调控且反映鱼类生长速度的重要参数之一。

蛋白质合成能力和血IGF-I的分泌受到生长阶段、饲料营养状况的影响与调控。对虹鳟（Mathers等，1993）、大菱鲆（Imsland 等，2002）的研究表明，快速生长发育期的鱼类蛋白质合成能力可作为鱼类生长的衡量指标。研究表明，饲料蛋白质水平的增加促进白肌蛋白质合成能力和生长是通过增加RNA/DNA和IGF-I来实现的。对翘嘴鲌（王桂芹等，2008）、鲤鱼（Higucra 等，1998）的研究表明，饲料氨基酸的平衡程度对生长影响是通过蛋白质合成能力和IGF-I来调控的，但华益民和林浩然（2001）研究不同饲料蛋白水平对鲤鱼内分泌的影响时发现，不同蛋白质水平对IGF-ImRNA无显著影响，可能是因为IGF-I表达的调节是一个相对缓慢的过程，试验时间只有30 d的缘故。本试验表明蛋白质是调控RNA/DNA和IGF-I的合成的一个重要调节因子。关于饲料能量和维生素B6对鱼类RNA/DNA和IGF-I的影响未见报道。本试验适宜蛋能比（23.3 g/MJ）通过提高血中IGF-I的含量来调控蛋白质的合成，从而促进生长，这与对真鲷（Marti等，1996）和虹鳟（Eales等，1992）的研究结果一致，即适宜蛋能比能促进激素的分泌，从而促进生长。本试验说明可消化蛋白质水平在34.5%～42.0%时，饲料中增加维生素B6（18～30 mg/kg）的添加量，可促进蛋白质的合成，提高血中IGF-I的含量从而促进生长。这与在虹鳟（Smith等，1974）和罗非鱼（Liral等，1995）饵料中应添加足量的维生素B6，可提高蛋白质的沉积率研究结果一致。在饲料低蛋白质水平条件下，蛋白质中含氮化合物的代谢强度较低，对饲料中维生素B6的需求量也较低；在饲料高蛋白质水平下将增加机体对维生素B6的需要量，所以一定水平饲料蛋白质需要一定量的饲料维生素B6作为其代谢过程中辅酶的前体来促进生长。

表4 饲料中维生素B6与蛋白质的交互作用对乌鳢生长、核酸与IGF-I含量的影晌

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