新奥霉素发酵液的理化性质和提取方法研究

宁停波 ，张 婷 ，周金燕 ，杨 杰 ，谭 红

（1.中国科学院成都生物研究所应用与环境微生物研究中心，四川 成都 610041；2.中国科学院研究生院生命科学学院，北京 100049）

近年来，农用抗生素的筛选和应用已成为农业微生物领域的研究重点，利用放线菌产生的抗生素制备的新农药已逐渐成为无公害农药的主体[1]。因此，从放线菌的发酵液中寻找新的农用抗生素产物成为当前国内外的一个研究热点[2]。

核苷类抗生素具有多样的生物活性[3]，在医疗、农药方面都有重要应用。由于来源于微生物的核苷类抗生素具有低毒和环境友好的特点，且在抗菌、杀虫和抗病毒等方面具有较强的作用，所以相关研究越来越受到关注[4]。本实验室从攀西地区土壤中筛选得到一株诺尔斯链霉菌（streptomyces noursei），该菌产生一种具有高效、广谱抗菌作用的新型核苷类农用抗生素——新奥霉素（专利申请号，200910060121.4），经多轮诱变选育，已具有工业开发价值。本文就新奥霉素发酵液的理化性质及其提取方法进行了研究，为新奥霉素的发酵生产和农业应用提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

菌种：本实验室从攀西地区土壤中筛选得到的诺尔斯链霉菌（streptomyces noursei）XiAo-3。生测指示菌：蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus），购自云南省微生物研究所保藏中心。生测培养基：牛肉膏蛋白胨培养基。发酵液：诺尔斯链霉菌（streptomyces noursei）XiAo-3经发酵罐发酵后提供。试剂和仪器：硅胶G薄层板、硅胶G200～300目（青岛海洋化工），C18反相硅胶（YMC）；甲醇、氯仿、正丁醇、冰乙酸为分析纯，去离子水；微滤装置（成都连接流体分离科技有限公司），纳滤膜（GE Water&Process Technologies），BUCHI-114 型旋转蒸发仪，SBS-100型数控记滴自动分部收集器，高压液相色谱系统为SHIMADZU（岛津）液相色谱仪系统。

1.2 发酵液的预处理

发酵液中添加珍珠岩助滤剂，经过滤去除菌体和培养基残渣。

1.3 发酵液理化性质

1.3.1 热稳定性 各取10 mL发酵液于5支试管中，分别于 40、60、80、100℃下静置 30、60、90 min，定时取出2 mL发酵液留作生测样品，冷却至室温，管碟法测抑菌圈直径，每个样品重复3次。

1.3.2 pH稳定性 将发酵液用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH 分别调节 pH 值至 1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0、13.0，静置 24h 后，均调回发酵液初始 pH值，以未处理的发酵液为对照，管碟法测抑菌圈直径，每个样品重复3次。

1.3.3 紫外稳定性 将等量的发酵液置于波长为254 nm的紫外灯下分别照射15、30、45和60 min，以未处理的发酵液为对照，管碟法测抑菌圈直径，每个样品重复3次。

1.4 新奥霉素的提取方法

新奥霉素发酵液经助滤剂过滤后所得滤液，采用膜处理方法获得新奥霉素浓缩液[5-6]；采用乙醇沉淀预处理发酵液，其上清液样品经过两次正相硅胶柱层析，再经减压蒸发浓缩，可得白色或淡黄色粉末的新奥霉素。具体提取工艺路线，见图1。

图1 新奥霉素提取工艺

1.4.1 新奥霉素的膜提取方法 采用微滤（MF）—纳滤（NF）组合分离法[7-8]制备新奥霉素浓缩液，具体工艺流程：将预处理的发酵液进行微滤，其透过液再经纳滤，获得新奥霉素浓缩液（图2）。

1.4.2 乙醇沉淀 取4份发酵液，分别加入2、4、6、8 倍体积无水乙醇，静置 1h，离心（6 000 r/min，15 min），分离上清液和沉淀，以未处理发酵液为对照，管碟法测抑菌圈直径，每个样品重复3次。

图2 微滤-纳滤装置

1.4.3 正相硅胶柱层析 取适量乙醇沉淀上清浓缩液干法上样，两次正相硅胶柱层析的上样量与硅胶装柱量比例分别为1∶5、1∶67，采用不同梯度的氯仿/甲醇/水洗脱。

1.5 检测方法

1.5.1 抑菌活性的测定 取含菌量为（6.4～10）×107个/mL蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）悬液，以体积比0.5%的比例添加到58℃左右的生测培养基中，混匀后迅速制成平板培养基，待凝固后将灭菌的牛津杯等距离均匀摆放，每个牛津杯加样量200 μL（所有样品均稀释30倍），置30℃恒温培养17 h后，测量抑菌圈直径。

1.5.2 HPLC检测 色谱柱:Agilent HC-C18柱（4.6×250 mm），λ：265 nm，流动相：甲醇/水（5/95，加0.05%冰乙酸)，流速：0.5 mL/min，柱温：40℃。

2 结果与分析

2.1 发酵液的理化性质

2.1.1 热稳定性 由表1可知，新奥霉素具有较好的热稳定性。发酵液分别在40、60和80℃条件下，保温90 min后，新奥霉素活性基本一致；但温度达到100℃，保温90 min后活性有所下降。因此，在分离提取过程中应尽量避免过高的温度，减少对新奥霉素抑菌活性的影响。

表1 发酵液热稳定性

2.1.2 pH值稳定性 新奥霉素发酵液初始pH值为3（CK），发酵液经酸、碱分别处理后，回调pH值至3，生测结果见图3。结果表明用酸对发酵液处理后，其活性有微小的上升，而用碱处理后，抑菌活性随着pH值的升高，有所下降。

图3 发酵液pH值的稳定性

2.1.3 紫外稳定性 从图4可知，新奥霉素发酵液对紫外照射不敏感。发酵液经过254 nm紫外光照射，抑菌活性无明显变化，说明发酵液中的新奥霉素具有很好的紫外稳定性，无需避光保存。

图4 发酵液紫外稳定性

2.2 新奥霉素的提取

2.2.1 膜分离提取新奥霉素 本实验采用管式陶瓷膜对发酵液进行微滤，柱前后压差1.3 kg，温度25℃，流速8 L/h，透过液澄清且活性基本无变化。微滤透过液进入纳滤装置，柱前后压差0.7 kg，温度28℃，流量4 L/h，浓缩了5倍，活性回收率达90%以上。纳滤可节省生产消耗成本，其截留浓缩液可以进一步进行纳滤浓缩，制备浓度更高的新奥霉素母液。

图5 不同体积倍数乙醇沉淀发酵液的影响

2.2.2 乙醇沉淀发酵液 采用不同体积倍数无水乙醇处理发酵液，去除一些杂蛋白质。结果表明，随着乙醇体积倍数的增大，析出的固形物增多，上清液的抑菌活性减小（图5），而沉淀的抑菌活性增加。当使用8倍体积乙醇沉淀发酵液时，沉淀的抑菌圈直径已与上清液的抑菌圈直径相近，说明此时新奥霉素已被大量沉淀。综合考虑无水乙醇用量和新奥霉素的活性收率，选择用4倍体积无水乙醇处理发酵液，活性收率在90%以上。

2.2.3 新奥霉素的柱层析分离 发酵液醇沉上清浓缩液经过第一次正相硅胶柱分离发现，当采用第一梯度洗脱剂（氯仿/甲醇/水体积比为 6.5∶3.5∶0.7）时，能洗脱大量色素和其它弱极性的物质；在第二梯度洗脱剂（氯仿/甲醇/水体积比 4.5∶5.5∶1.2）中，新奥霉素能够被集中洗脱下来，在55℃减压蒸发得到棕色膏状样品。此样品经第二次硅胶柱分离，合并收集活性部分的洗脱液，浓缩干燥，得到白色或淡黄色新奥霉素粉末，经HPLC初步检测新奥霉素峰面积大于97%，见图6。

图6 二次硅胶柱层析得到的新奥霉素HPLC图谱

3 结论

新奥霉素是一种水溶性抗生素，其发酵液具有较好的紫外和热稳定性，对酸碱不敏感。通过对新奥霉素发酵液理化性质的研究，可以有效地指导新奥霉素提取工艺条件，获得较高的活性收率。新奥霉素发酵液添加珍珠岩助滤剂预处理，过滤得到的滤液，采用微滤-纳滤组合分离法可以获得体积浓缩5倍、活性收率90%以上的新奥霉素浓缩液；采用4倍体积无水乙醇沉淀和两次正相硅胶柱层析，可以获得含量大于97%的白色或淡黄色新奥霉素粉末。

利用膜工艺技术制备新奥霉素浓缩液的过程具有步骤简单、耗能小等特点，且产品可进一步加工为新奥霉素母液进行工业化生产。由于本文提取新奥霉素粉末工艺的生产成本较高，所以还有待于进一步改进。

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