黄荆子乙酸乙酯提取物及其活性成分对人卵巢癌CoC1细胞生长的影响

邓宇傲 谢宛玉 李秀云 曹建国

1．广东省暨南大学第二临床医学院深圳市人民医院妇科，广东 深圳 518020;2．湖南省南华大学附属第一医院妇产科，湖南 衡阳 421001;3．湖南师范大学医学院，湖南 长沙 410006

卵巢癌是妇科肿瘤中病死率最高的疾病，上皮来源的卵巢癌5年存活率仅为39%［1］。黄荆子 (Vitex negundo seed)为黄荆的果实，药理学研究证实黄荆子提取物具有广泛的药理作用。近年来，其抗肿瘤作用引起了人们的极大兴趣。木脂素 (lignan)是自然界中广泛存在的一类物质，具有抗肿瘤，抗病毒，调节激素平衡，抑制血小板活化因子 (PAF)，抗氧化，护肝及抗炎等生理功能，尤其是抗肿瘤作用目前备受关注。本文对黄荆子乙酸乙酯提取物EVn－50及从中分级分离获得的4种木脂类化合物进行体外抗人卵巢癌研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 人卵巢癌CoC1细胞系购于中国典型培养物保藏中心。

1.1.2 药品 注射用DDP冻干粉剂:齐鲁制药有限公司生产，批号:6030052DB;

黄荆子乙酸乙酯提取物EVn－50及从中分级分离获得的四种化合物Comp 6、Comp 7、Comp 8、Comp 10均由中南大学药学院周应军博士惠赠，四种化合物由中南大学化学化工学院进行结构鉴定为木脂类。

1.1.3 试剂 台盼兰、二甲基亚砜 (DMSO)、RPMI－1640培养基为美国Sigma公司产品;新生小牛血清由杭州四季青生物工程材料有限公司生产。

1.2 方法

1.2.1 黄荆子提取物的配制 称取EVn－50及各化合物各2.5mg，用10μL DMSO溶解后，加入PBS分别配成0.5mg/ml的母液5ml;经0.45μm滤菌膜过滤后，再在无菌条件下将滤液经过0.22μm滤菌膜过滤除菌，密封包装后置于4℃冰箱中保存，临用前按所需浓度稀释。

1.2.2 细胞培养 用含10%小牛血清的RPMI 1640，置5%CO2、37℃、饱和湿度条件下培养，每2－3天传代一次。

1.2.3 细胞计数法检测EVn－50及木脂类化合物对细胞生长的影响

1.2.3.1 细胞存活率测定

取对数生长期CoC1细胞，用完全培养基调整细胞浓度为2.0×104/mL，以1mL/孔接种于6孔培养板中，分别加入100μL受试物，使其终浓度为0.1，1.0，10.0μg/mL;DDP终浓度为0.02，0.2，2.0μg/mL;溶媒对照组加入相同体积终浓度为0.02%DMSO的完全培养基。每组设3个复孔，孵育48h，台盼蓝染色后，显微镜下计数拒染活细胞数。计算公式:细胞存活率=处理组的活细胞均数/空白对照组活细胞数×100%;细胞生长抑制率 (%)=(1－细胞存活率)×100%。

1.2.3.2 生长曲线的绘制

取对数生长期CoC1细胞，用完全培养基调整细胞浓度为2.0×104/mL，以1mL/孔接种于6孔培养板中，加入100μL/孔受试物，使其终浓度为1.0μg/mL，DDP终浓度为0.2μg/mL;溶酶对照组加入相同体积终浓度为0.02%DMSO的PBS，每浓度设3个复孔。每天台盼蓝染色后，分别计数活细胞数，连续计数4天，经3人盲法计数，取平均数，以每次所得的细胞平均数为纵坐标，时间为横坐标绘制生长曲线图。

1.2.4 统计学方法

计量资料数据采用x±SD表示，均重复3次以上。采用SPSS Windows for 11.5软件分析并绘制图形。

2 结果

2.1 量效关系检测

实验结果显示 EVn－50及黄荆子木脂类化合物能降低人卵巢癌CoC1细胞存活率，呈浓度依赖性;其中，以Comp 8、EVn－50效价较高，IC50分别为 1.40μg/mL、1.56μg/mL(图1)。

2.2 时效关系检测

台盼蓝染色后细胞计数结果显示:EVn－50及黄荆子木脂类化合物能有效降低人卵巢癌CoC1细胞活细胞数目，呈时间依赖性;其中，以Comp 8、EVn－50作用较强，绘制生长曲线图 (图2)。

3 讨论

黄荆系被子植物马鞭草科牡荆属植物，黄荆的果实即黄荆子。黄荆子提取物具有抗炎、解热镇痛、抗氧化、抗菌、降血糖、调节内分泌、免疫等作用［2－3］。近年来，黄荆子提取物的抗肿瘤作用引起了人们的极大兴趣，据报道，黄荆子提取物对人肺癌细胞 (PC－12)、人结肠癌细胞(HCT116)、人口腔鳞状细胞癌细胞 (KB)、人乳腺癌细胞(MCF －7)［4］及人宫颈癌细胞 (Hela)［5］等多种肿瘤细胞的生长有显著抑制作用。

研究证实木脂类是一类具有广谱抗肿瘤活性的天然物质，且该类化合物中的鬼臼毒素 (Podophyllotoxin)的衍生物已在临床上得到较广泛的应用。以鬼臼毒素为母体的半合成衍生物依托泊甙 (VP－16，etoposide)和替尼泊甙(VM－26，teniposide)已于1983年经美国FDA批准用于应用于临床，对于小细胞肺癌、前列腺癌、膀胱癌、睾丸癌、卵巢癌、脑瘤等恶性肿瘤的治疗均取得了显著的疗效。

本实验结果显示，EVn－50及木脂类化合物Comp 8对人卵巢癌CoC1细胞的生长具有显著抑制作用，呈浓度及时间依赖性;Comp 8在0.1、1.0、10.0μg/mL浓度时对CoC1细胞的生长抑制率分别为17%、55%、70%，IC50值为1.40μg/mL;EVn－50在 0.1、1.0、10.0μg/mL 浓度时对CoC1细胞的生长抑制率分别为19%、50%、69%，IC50值为1.56μg/mL，与阳性对照药物顺铂比较无显著差异。据此，我们认为黄荆子乙酸乙酯提取物EVn－50及由其分级分离获得的Comp 8在体外能显著抑制人卵巢癌细胞的生长，木脂类化合物是该提取物中抗人卵巢癌的活性成分，这为研究黄荆子提取物及其活性成分的抗肿瘤作用提供初步实验依据。黄荆子乙酸乙酯提取物及木脂类化合物在体治疗卵巢癌的有效性及其作用机制等有待进一步探讨。

［1］ Fagotti A，Gallotta V，Romano F，et al．Peritoneal carcinosis of ovarian origin ［J］．World J Gastrointest Oncol．2010，2(2):102 －8．

［2］ Sathiamoorthy B，Gupta P，Kumar M，Chaturvedi AK，Shukla PK，Maurya R．New antifungal flavonoid glycoside from Vitex negundo［J］．Bioorg Med Chem Lett．2007 ，17(1):239－242．

［3］ Yuan L，Xue M，Liu Y，Wang H．Toxicity and oviposition－deterrence of Vitex negundo extracts to Plutella xylostella ［J］．Ying Yong Sheng Tai Xue Bao，2006，17(4):695－698．

［4］彭娟，周应军，封萍，刘丽华，童平珍，曹建国．黄荆子乙酸乙酯提取物抑制人乳腺癌MCF－7裸鼠移植瘤生长［J］．湖南师范大学学报 (医学版)，2007，4(3):17－19．

［5］董巍檑，周应军，曹建国，陈忠东．黄荆子乙酰乙酯提取物的抗人宫颈癌作用［J］．南华大学学报 (医学版)，2008，36(1):42－45．