超高效液相色谱法检测西红花中非法添加的染料金橙Ⅱ

胡晓炜

金橙Ⅱ又名酸性橙Ⅱ、二号橙、桔黄橙、酸性金黄Ⅱ或酸性艳橙GR，俗名金黄粉，化学名为2－萘酚偶氮对苯磺酸钠，是一种化工染料，主要用于皮革、纺织物染色，禁止作为食品添加剂使用。但其具有色泽鲜艳、着色稳定、价廉等特点，一些不法商贩为了牟取暴利，将其用于药材生产与加工，严重危害了消费者健康。西红花又称番红花，是名贵的中药材。为及时准确判断西红花中是否存在金橙Ⅱ，建立一套快速、准确的金橙Ⅱ检测方法具有重要意义。笔者以金橙Ⅱ为指标成分，建立了定性定量测定西红花中金橙Ⅱ的超高效液相色谱－串联质谱(UPLC－MS/MS)法，可为西红花的质量控制提供参考。

1 仪器与试药

UPLC超高效液相色谱仪(Waters公司)。金橙Ⅱ(批号为20070520，上海万坤化学试剂有限公司);乙腈(色谱纯)，水(重蒸水)，醋酸铵(分析纯);西红花(市售品，编号分别为Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

2.1.1 液相色谱条件

色谱柱:BEH C18柱(50 mm ×2.1 mm，1.7 μm);柱温:室温(30℃);流动相:乙腈－0.01 mol/L醋酸铵溶液(30∶70);流速:0.3 mL/min;检测波长:484 nm。西红花样品、金橙Ⅱ的紫外色谱图、TIC图及MRM图见图1和图2。标准品与样品进样量均为1μL。

2.1.2 质谱条件

离子源参数:离子化模式为ESI+;毛细管电压为2.24 kV;样品锥孔电压为60 V;二孔锥孔电压为3 V;六极杆透镜电压为0.3 V;离子源温度为150℃;脱溶剂气温度为250℃;脱溶剂气流量为600 L/HR;锥孔气流量为50 L/HR。

质谱相关参数:一级质谱分辨率为15.0，离子能量为0.5 eV;二级质谱分辨率为15.0，离子能量为1.0 eV;光电倍增管电压为650 V;碰撞能量为30 V;氩气流速为0.16 mL/L。

子离子扫描参数:母离子质量数为328.9 m/z;子离子扫描范围100.0～340.0 m/z;样品锥孔电压为60 V;碰撞能量为30 V;扫描时间为0.2 s;扫描时间间隔为0.1 s;通道之间扫描间隔(Interchannel delay)为0.02 s。二级离子监测扫描模式(MRM)参数见表1。

2.2 溶液制备

图1 样品的LC－MS/MS分析图

图2 金橙Ⅱ的LC－MS/MS分析

表1 MRM参数

精密称取金橙Ⅱ适量，用甲醇定量至100 mL，得对照品贮备液，精密吸取该溶液适量，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得对照品溶液。精密称取西红花样品粉末(过40目筛)0.2 g，加70%乙醇20 mL后称重，超声提取20 min，放冷，用70%乙醇补足减失的质量，取70%乙醇液，过0.2μm微孔滤膜，作为供试品溶液。

2.3 方法学考察

标准曲线绘制:精密称取金橙Ⅱ10.87mg，用甲醇定容至100mL，得对照品贮备液，精密吸取此溶液 0.5，2.0，5.0 mL，置 10 mL 量瓶中，加甲醇到刻度，摇匀，进样1μL;精密称取金橙Ⅱ14.90 mg，加甲醇定容至10 mL，得对照品贮备液，精密吸取此溶液1.0，5.0 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇到刻度，摇匀，进样1μL。以对照品质量浓度对峰面积平均值作图，线性回归方程为 A=306.511 2+112.364 5 C，r=0.999 0。结果表明，金橙Ⅱ的进样量线性范围为5.435 ～ 745.0 ng。

精密度试验:取同一质量浓度的对照品溶液，连续5次进样。结果峰面积的 RSD为0.58%(n=5)。

稳定性试验:取同一供试品溶液，于10 h内每隔2 h进样1次。结果金橙Ⅱ含量的 RSD为1.23%(n=5)，表明供试品溶液在10 h内保持稳定。

重复性试验:取同一样品各5份，依法制备供试品溶液并测定含量。结果金橙Ⅱ含量的 RSD为1.49%(n=5)。

回收率试验:精密称取已知不含金橙Ⅱ的西红花粉末5份，分别加入金橙Ⅱ溶液适量(精密称取金橙Ⅱ14.90 mg，用甲醇定容至10 mL，得对照品贮备液;精密吸取此溶液1.0 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释到刻度，摇匀，精密移取0.3 mL)，依法测定。结果见表2。

表2 样品中金橙Ⅱ回收率试验(n=5)

检测限确定:通过逐级降低对照品溶液质量浓度，进样测定，确定金橙Ⅱ的最小检出限(S/N=3)为6μg/L。

2.4 样品检测

取4批样品，依法测定含量，结果样品Ⅰ中金橙Ⅱ含量为2.624 mg/g，样品Ⅱ～Ⅳ中未检出金橙Ⅱ。取样品，经液相色谱柱分离后进入质谱仪，产生了[M+H－Na]+峰328.9(金橙Ⅱ的分子式为C16H11N2NaO4S，相对分子质量为350.3)，二级质谱的特征碎片离子(107.8，127.8，155.9，172.7)明显。样品及对照品的质谱图见图1和图2。

3 讨论

金橙Ⅱ易溶于70%乙醇，选择超声前处理法可快速完全地将金橙Ⅱ从样品中提取出来。超声处理时间(5，10，20，30 min)考察结果表明，20 min样品已提取完全。

金橙Ⅱ的检测方法有高效液相色谱法[1]。由于超高效液相色谱与传统的高效液相色谱技术相比效率更高，因而具有更强的分离能力。超高效液相色谱提供了超高速度、高灵敏度，金橙Ⅱ出峰时间在1.7 min，全部分析在3 min内即可完成。本检测方法简单、快速、准确，为快速检定西红花中掺加的金橙Ⅱ提供了可靠依据。

[1]顾万江，肖义夫.食品中金橙Ⅱ反相高效液相色谱法测定[J].预防医学情报杂志，2006，22(6):753－755.