葡萄籽提取物原花青素对大鼠实验性隐睾生精细胞凋亡的影响

易芳芳,龚 建，朱秀娟，向 真，袁云香，贺丽萍

（湖南师范大学医学院，湖南 长沙410006）

睾丸生精细胞凋亡是生精过程中产生的一种生理现象，隐睾由于生精细胞的过度凋亡而使生精功能低下，甚至导致不育。隐睾所致的生精细胞过度凋亡与活性氧所致的过氧化有关。原花青素是一种良好的氧游离基清除剂和脂质过氧化抑制剂，可有效清除超氧阴离子自由基和羟基自由基，也参与磷脂、花生四烯酸的新陈代谢和蛋白质磷酸化，保护脂质不发生过氧化损伤[1，2]。本实验通过模拟隐睾模型，探讨原花青素对大鼠实验性隐睾生精细胞凋亡的影响。

1 材料和方法

1.1 动物模型的建立及处理

40只健康雄性SD大鼠 (42日龄，体重120～160g)，购自湖南农大实验动物中心。喂养7天后，随机分为隐睾+原花青素(低、中、高剂量组分别按300,450,600 mg/kg，稀释至 5mL，)组、隐睾+生理盐水组 （生理盐水5 mL）、假手术组。巴比妥钠(50mg/Kg)腹腔内注射麻醉，下腹正中切口，假手术组将左侧睾丸切断引带后还纳入阴囊关腹。其他五组大鼠切断左侧睾丸引带后，用5-0尼龙线将左侧睾丸固定于腹后壁后关腹。术后隐睾+生理盐水组及隐睾+原花青素(高、中、低剂量)组分别灌胃给予生理盐水和原花青素，每天三次，定时定量灌胃，7天后快速脱颈椎法处死所有大鼠，双侧睾丸称湿重，之后置4%多聚甲醛中固定。

1.2 主要试剂

原花青素为红棕色粉末(南京泽朗医药科技开发有限公司)，纯度95% ，临用时用30℃温水配置成混悬液。DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物工程公司，细胞凋亡检测试剂盒购自南京建成生物工程公司。

1.3 TUNEL法检测

4%多聚甲醛固定睾丸，常规脱水，透明，包埋。将已固定的各组睾丸常规组织切片，厚度5 μm，裱于用多聚赖氨酸处理的载玻片上烤干备用。每个蜡块取部分切片常规H.E染色，并取部分切片作TUNEL原位末端标记，步骤按细胞凋亡试剂盒产品说明书进行。DAB显色，光镜观察。

1.4 结果判定

TUNEL法：光镜下凋亡细胞的胞核呈棕褐色，阴性对照用磷酸缓冲液代替DNA末端转移酶。每个睾丸组织切片随机观察10个生精小管横断面，以凋亡细胞数占每个生精小管生精细胞总数的比例，取其平均值计算凋亡指数(AI)，进行统计分析[3]。

1.5 统计分析

计量资料均采用均数±标准差表示，应用SPSS10.0统计软件对组间均数进行单因素方差分析(t检验)，P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两侧睾丸大体改变及重量变化

术后第7天，除假手术组外，其余各组大鼠右侧睾丸正常，左侧睾丸体积明显缩小(图1)，重量均轻于右侧睾丸，但原花青素组左侧睾丸较其右侧睾丸缩小的程度明显轻于生理盐水组，其重量明显大于生理盐水组左侧睾丸重量，各组大鼠两侧睾丸重量变化见表1。

表1 各组大鼠双侧睾丸重量变化(mean±SD)

2.2 各组大鼠左侧睾丸的组织学变化

如图2所示，假手术组睾丸生精上皮(图2 A)中生精细胞排列有序，生精小管内可见到各级生精细胞，形态正常；生理盐水组均可见到生精小管内生精细胞排列紊乱，生精细胞与精子的数量减少，可见较多凋亡小体以及多核巨细胞(图2 B)，原花青素组睾丸生精上皮(图2 C,D,E)较生理盐水组厚，可见到少量多核巨细胞，且随着剂量的升高多核巨细胞数量减少。间质细胞和支持细胞的形态结构无明显改变。

2.3 TUNEL法对生精细胞凋亡的检测

各组睾丸内均可见到胞核为黑褐色的凋亡的生精细胞，包括初级精母细胞，精原细胞和精子细胞均可发生凋亡，假手术组睾丸(图3 A)可见散在的少量凋亡细胞，生理盐水组睾丸生精小管 (图3 B)内出现大量凋亡细胞，管壁变薄，生精细胞数量明显减少，原花青素组生精小管(图3 C,D,E)较生理盐水组出现相对较少的凋亡细胞，且随着原花青素剂量的升高凋亡细胞的数量逐渐减少。各组生精细胞凋亡指数见表2。

表2 左侧睾丸生精细胞凋亡指数(AI)的变化

3 讨论

隐睾是常见的男性先天性泌尿生殖系畸形之一，即睾丸未能按正常发育过程通过腹股沟管沿着腹膜鞘突下降至阴囊底部,而停留在下降途中任何部位。在足月男性新生儿中的发病率为4%～5%,早产儿为9%～30%[4]。目前隐睾症的药物治疗主要是激素，而本实验研究的原花青素通过抗氧化作用保护隐睾可以为隐睾的药物治疗提供更多的选择。40多年来人们对从众多不同植物中提取出的原花青素进行了大量研究,原花青素得到了最为深入和广泛的关注。但是国内对葡萄籽提取物原花青素在隐睾中抗生精细胞凋亡的研究还较少。

原花青素是一种良好的氧游离基清除剂和脂质过氧化抑制剂，并以高效、低毒、高生物利用度而著称，其主要作用有：①有效地清除超氧阴离子自由基和羟基自由基等，也可中断自由基链式反应。②参与磷脂、花生四烯酸的新陈代谢和蛋白质磷酸化，保护脂质不发生过氧化损伤等[5]。

睾丸生精细胞凋亡是生精过程中产生的一种生理现象，而隐睾可使睾丸正常的生精过程发生紊乱并可导致生育能力低下。我们在实验中发现，隐睾术后大鼠手术侧睾丸均发生萎缩，体积、重量均小于对侧睾丸，组织学隐睾生精细胞和精子数量大大减少，有较多特征性的凋亡多核巨细胞。这说明本实验成功制作了隐睾模型。

本实验室前期工作表明，隐睾所致生精细胞凋亡的机制与活性氧所致的过氧化有关[6]，且通过使用活性氧抑制剂能够显著减轻隐睾生精细胞凋亡的程度。本实验中研究所用的原花青素是一种良好的抗氧化剂，使用了原花青素的SD大鼠组两侧睾丸体积、重量变化较生理盐水组小，且组织学观察和TUNEL法细胞凋亡检测结果都显示隐睾术后给予原花青素能使隐睾中生精细胞的凋亡减少。本实验结果表明，原花青素能显著抑制隐睾生精细胞的凋亡，因此我们推测，原花青素能够抑制隐睾生精细胞凋亡是因为其能抑制隐睾中过多的活性氧的产生，本研究为临床治疗某些特发性男性不育症药物的开发研究提供了实验依据，同时也对隐睾下降术后改善生精功能的药物干预提供了新思路。

[1]丰田娟,徐贵发.葡萄籽提取物抗氧化功能的实验研究[J].食品与药品,2007,9(1):17-18.

[2]石金凤,赖琼,谢远杰.SB203580对大鼠隐睾生精细胞凋亡的影响[J].解剖学杂志,2007,30(2):157-159.

[3]Amiya P,Sinha H,Christina W,et al.Inwolvement of apoptosis in the induction of germ cell degeneration in adult rat after gonadotropin releasing hormone[J].Endocianology,1995,136(6):2770-2775.

[4]丰田娟,徐贵发.葡萄籽提取物对人体抗氧化能力的影响[J].山东大学学报(医学版),2007,45(10):985-987.

[6]李美香,贺丽萍,谢远杰,等.硝普纳和L-硝基-精氨酸甲酯对大鼠生精功能的影响[J].中华男科学,2003,10(5):327-329.

[7]谢远杰,李美香,赖琼,等.N2硝基2L2精氨酸甲酯对大鼠实验性隐睾生精细胞凋亡及Bax表达的影响[J].解剖学报,2006,37(6):710-712.