肾小球分离与纯化在肾脏病学中的应用

赵瑾瑶丁艳芳刘 斌杨 亮王 波张赫晨崔世英

肾小球分离与纯化在肾脏病学中的应用

赵瑾瑶1丁艳芳1刘 斌1杨 亮1王 波2张赫晨1崔世英1

目的：发明一种快速易行的肾小球分离技术，为肾脏病学研究服务。 方法：小鼠麻醉后，经体循环灌注四氧化三铁溶液，使肾小球内的毛细血管中充满四氧化三铁溶液。然后取出肾脏切碎，用collagenase A消化，细胞器滤过，磁铁吸附并收集含铁的肾小球。光镜、透射和扫描电镜观察肾小球的正常形态和结构。常规方法提取RNA和蛋白质，并进行qRT-PCR、micro RNA（miRNA）基因芯片和Western blot等定量检测。 结果：该方法可从新生小鼠和成体小鼠的肾脏中高质量快速提纯不同发育阶段（发育早期、中期或晚期）及成熟的肾小球，分离后的肾小球光镜形态结构以及超微结构均保存完好。常规方法提取的RNA和蛋白质可用于qRT-PCR、Western blot检测以及miRNA基因芯片等分子生物学的定性和定量分析研究。 结论：该研究所述的肾小球分离技术费用低廉，简便易行，为基础与临床探索肾小球对各种肾脏疾病的基因调控作用和发育分子生物学研究提供了重要的方法和技术手段。

肾小球 肾小球分离 四氧化三铁

肾小球是肾脏的重要组成部分和基本功能单位，具有滤过血浆形成原尿，辅助排泄代谢产物及维持体液酸碱平衡等作用［1］。据报道周身血液每4 min流经肾脏一次，每天约有180 L水分流经肾小球，可见肾小球对人体各组织器官的生理功能的重要性。肾小球由生后肾原基发育而成，经由S形小体，早期、中期和晚期毛细血管袢（capillary loop），最后形成肾小球［2］。成熟肾小球主要由四种细胞构成：肾小囊脏层细胞 （足细胞）、毛细血管內皮细胞、肾间质细胞及肾小囊壁层细胞［3］。肾小球正常发育以及滤过功能的正常维持对预防肾脏疾病至关重要［1］。

众所周知，各种肾脏病若不及时治疗和控制，病情逐渐发展，均可引起慢性肾功能不全，直至肾功能衰竭（肾衰竭）［4］。80%～90%肾衰竭源于肾小球的损伤［5，6］，如全身及肾小球性高血压导致的内皮细胞损伤、急/慢性肾炎引起的肾小球滤过屏障和电荷屏障的损伤、长期大量蛋白尿对肾小球的损伤、高胆固醇饮食引起的肾单位进行性破坏和肾小球内凝血等。所以治疗肾衰竭关键在于修复损伤的肾小球，只有肾小球结构功能正常了，才能从根源治疗肾衰竭，提高患者生命质量。但目前能修复肾小球结构的药物很少，其基本原因就是肾小球发育、修复的基因调控与分子作用通路尚不清楚。

小鼠体积小、经济、孕期短，且基因组型与人类极其相似，是当今分子生物学，医学研究的首选实验动物。特别是小鼠被广泛应用于各种肾小球疾病转基因动物模型。因此从小鼠肾脏提纯不同发育阶段的肾小球对肾脏发育、疾病的分子生物学及其基因调控的研究有着极其重要的作用。本研究旨在报道一种新方法，从新生及成年小鼠肾脏中快速、经济、大量提纯正在发育和成熟的肾小球，利用此方法分离的肾小球可以按常规方法抽提RNA和蛋白质，用于分子生物学的定性与定量分析研究。

材料与方法

实验动物 出生一天（D1）和生后4周（D28）清洁级昆明种小白鼠，由大连医科大学实验动物中心提供。

试剂及仪器 collagenase A（美国Sigma）；四氧化三铁（黑色粉末状，颗粒直径大小＜5μm美国Sigma货号：310050）；磁铁；100μm细胞滤过器（美国BD）；Trizol（美国invitrogen）；high-capacity cDNA RT kit（美国ABI）；SYBR GREEN PCR MASTER MIX（美国ABI）；mercury Labeling Kit（丹麦Exiqon）；ECLIPSE 80i显微镜（日本Nekon）；LKB-5型超薄切片（日本）；透射电镜（日本JEM-200EX，JEOL）；NanoVue超微量分光光度计（美国GE）；Bioanalyzer-2100（美国Agilent）；Mx3000P荧光定量PCR仪（美国Agilent）；Mini PROTEAN 3电泳槽（美国bio-rad）；Mini Trans-Blot转印槽（美国bio-rad）；Biolmaging system（美国UVP）。

肾小球提纯 2.5%水合氯醛腹腔注射，D1小鼠注射0.15 ml，成体小鼠需0.4 ml，麻醉后剖开小鼠胸、腹腔，由左心尖进针，剪开右心耳经体循环灌注0.001～0.003 g/ml四氧化三铁溶液4～5 ml，待肾脏变成灰黑色后，取出肾脏将其切成1 mm3的碎块放入含有150μg/ml Collagenase A的PBS中，于37℃水浴中消化15～20 min，将消化液经100μm孔径的细胞过滤器滤过至50 ml的试管中，并用5～7 ml冷PBS反复冲洗滤器。然后用磁铁吸附滤液至1.5 ml的EP管中，直至滤液中含铁的肾小球被全部吸附完为止，PBS洗涤以清除杂质。

形态学研究方法 （1）光镜样本处理：将提纯后的肾小球悬于PBS中，滴至载玻片上盖上盖玻片，光镜下观察并摄片。（2）扫描电镜制备：2.5%戊二醛、1%锇酸双固定，脱水，醋酸异戊酯置换，临界点干燥，喷金，扫描电镜下观察、摄片。（3）透射电镜样品制作：以2.5%戊二醛、1%锇酸双固定，EPON812常规包埋，LKB-5型超薄切片机切片，铀-铅双染色，透射电镜（JEM-200EX，JEOL）下观察、摄片。

RNA抽提、质量评估与确定 Trizol法提取分离后的肾小球的总RNA，使用NanoVue超微量分光光度计测定浓度，并根据260/280 nm吸光度比值判定其纯度。琼脂糖凝胶电泳观察RNA条带；另外使用Bioanalyzer-2100测定RNA在25～500 ng/μl浓度时的质量。

qRT-PCR法 使用high-capacity cDNA RT kit反转录RNA为cDNA，再用SYBR GREEN PCR MASTER MIX在Mx3000P荧光定量PCR仪上，反应条件：95℃15s，60℃1min，72℃10s，40个循环。

miRNA基因芯片 miRNA基因芯片在美国杜克大学完成：10μg总RNA用mercury Labeling Kit（丹麦Exiqon公司）标记后，使用Ambion mirVana miRNA Set2 probe（Ambion，AustinTX）和1140 of Invitrogen's NCode multispecies miRNA probes（Invitrogen，Carlsbad CA）探针进行杂交。再行GenePix 4000B扫描，最后利用GenePix Pro等软件进行基因表达分析。

蛋白质抽提与Western blot检测Stathmin 1（Stmn1）与Nucleophosmin（Npm1）（Stmn1和Npm1均为发育中肾小球的标记物）蛋白的表达：将分离后的肾小球于RIPA裂解液中，冰上充分裂解10～30 min，14000 rpm离心10 min吸上清，BCA试剂盒测定蛋白浓度。SDS-PAGE电泳，采用NC膜于BIO-RADⅢ型转印仪电转；5%奶粉室温封闭；一抗（COL4A2 1：500，β-actin 1∶500）4℃过夜；二抗（1∶5 000）室温1h；ECL化学发光，并摄片。

结 果

肾小球分离后的形态与结构 光镜下可见分离后的肾小球形态保存完好，除成熟肾小球外，尚可见不同发育阶段的肾小球，数量最多的为毛细血管袢（capillary loop）早期和晚期肾小球（图1A、B）。扫描电镜观察可见完整肾小球外包裹的初级突起、次级突起以及次级突起之间的缝隙（图1C、D）。透射电镜进一步证明了分离后的肾小球超微结构完全正常，由足细胞次级突起间的裂孔膜，毛细血管內皮细胞，以及它们之间的基膜组成的滤过屏障保存完好（图1E、F）。

图1 肾小球分离后的形态与结构

肾小球分离后提取的RNA质量测定 15只D1小鼠提取的RNA总量为30.63μg，平均每只小鼠约为2μg。RNA的质量检测：（1）琼脂糖凝胶电泳图像显示：28S和18S条带清晰（图2A）。（2）Bioanalyzer-2100仪测定结果显示：肾小球分离后提取的RNA质量纯，性能完好（图2B），除RNA的两个峰值外，尚可见明显的miRNA峰值。

图2 肾小球分离后提取的RNA质量测定

肾小球分离后提取的RNA在分子生物学中的应用 qRT-PCR法结果显示在D1发育期肾小球的Stmn1表达明显高于D28成熟肾小球（图3A），表明Stmn1在肾小球发育中的调节作用。miRNA基因芯片结果显示D1发育阶段的肾小球与D28成熟肾小球的miRNA基因表达明显不同（图3B），说明miRNA表达在肾小球发育过程中具有的特异性。

肾小球分离后提取的蛋白质在分子生物学中的应用 我们利用两种方法，检验蛋白质抽提的浓度与质量：（1）肾小球分离后立即进行了蛋白质抽提，平均每个小鼠可抽提的蛋白量为128μg。（2）肾小球分离后于-80℃保存1～2周后进行蛋白质抽提，平均每个小鼠可抽提的蛋白量为80μg。为了验证这些蛋白质在分子生物学中的应用，我们利用肾小球分离后的蛋白质进行了Western blot检测Stmn1和Npm1的表达（图4），结果显示D1小鼠肾小球Stmn1和Npm1明显高于D28成熟肾小球，此结果与相关研究中的其他实验结果完全符合。并且Western blot检测内参β-actin的条带位置与标准蛋白Marker完全一致，进一步表明肾小球分离后提取的蛋白质完全可以满足Western blot检测方法。

图3 肾小球分离后提取的RNA在分子生物学中的应用

图4 肾小球分离后提取的蛋白质在W estern blot检测中的应用

讨 论

肾小球发育、修复的基因调控，靶向治疗与分子生物学调节通路的研究是当今肾脏医学领域中的热点，肾小球分离技术无疑是急需解決的关键技术。本研究介绍了一种新方法可从新生和生后成年小鼠的肾脏中快速提纯正在发育和成熟的肾小球，并对分离后的肾小球进行RNA和蛋白质的抽提。利用此方法提取的RNA和蛋白质可用于所有分子生物学的定性和定量分析与研究。为基础与临床探索肾小球对各种肾脏疾病的基因调控与发育分子生物学提供了重要的方法与技术。

由于肾小球在肾脏的特殊重要功能，2002年Takemoto等［7］首次开创了从小鼠成体肾脏分离肾小球的技术，为肾脏医学研究奠定了坚实的基础。但此技术费用极高，单从Invitrogen公司购买用于分离肾小球的试剂-Dynabeads就需五千多人民币。2005年Cui等［8-11］在研究Pod1（也称capsulin/ epicardin/Tcf21）（此为哺乳动物心脏［9］、肺脏［10］、肾脏［11］、生殖［12］等器官发育所必需的转录因子）时发现Pod1基因敲除小鼠由于其肺泡不能正常发育以及心衰等原因小鼠生后即死亡，因此成体小鼠肾小球分离技术不能满足转基因动物以及发育生物学肾小球领域的分子生物学研究。为此，2005年Cui等［8］首次建立了从胚胎小鼠肾脏提纯分离肾小球的方法。

近期，我们在从事肾小球发育的研究中，结合实际情况，克服了Takemoto等试剂价格昂贵的缺陷，借鉴了Cui等的胚胎肾小球提纯的基本技术手段，在方法、试剂、材料及其应用等方面均进行了一系列的改进与完善。其主要特点为：（1）方法简便易行：原方法中由于使用Dynabeads，肾小球分离前需要较长时间的预处理和氧化等操作，使肾小球分离步骤繁琐、过程复杂。此研究方法大大缩减了整个过程，可在2h内快速分离15～20只小鼠的肾小球。（2）费用低廉：我们将肾小球分离技术的主要试剂由四氧化三铁粉代替Dynabeads，经费是使用Dynabeads的1/12，大大节约了费用。所以在保证分离的肾小球质量和数量与原方法相似的基础上，为肾小球分离技术的广泛开展奠定了物资基础。（3）可大量提纯发育不同阶段以及成熟的肾小球：鉴于肾小球自胚胎的12～13d开始发育，至生后3周（D21～22）才全部成熟。所以，此技术可以根据研究者的需要，从生后不同年龄的小鼠分离各个发育阶段的肾小球。因为小鼠出生时，只有近20%左右的肾小球趋于成熟。（4）可以按常规方法从分离的肾小球中纯化RNA、miRNA和蛋白质：此方法利用抽提的RNA和蛋白质，不仅可以做RT-PCR、实时定量PCR和Western blot检测，还可以进一步从提取的RNA纯化出miRNA，并将其用于miRNA基因芯片研究，扩大了分离后肾小球在分子生物学的定性与定量的应用，直接推动了肾脏发育与肾小球修复研究的深入。

1 Quaggin SE，Kreidberg JA.Development of the renal glomerulus：good neighbors and good fences.Development，2008，135（4）：609-620.

2 Cui S，Ding Y，Zhao J，et al.Global definition of miRNA expression pattern of the developing and developed glomerulus inmice.JAm Soc Nephrol.2010 submitteed.

3 Brunskill EW，Potter SS.Gene expression programs of mouse endothelial cells in kidney developmentand disease.PLoSOne，2010，5（8）：e12034.

4 Lindenmeyer MT，Eichinger F，Sen K，et al.Systematic analysis of a novel human renal glomerulus-enriched gene expression dataset.PLoS One，2010，5（7）：e11545.

5 Alchi B，Jayne D.Membranoproliferative glomerulonephritis.Pediatr Nephrol，2010，25（8）：1409-1418.

6 Ahn SH，Susztak K.Getting a notch closer to understanding diabetic kidney disease.Diabetes，2010，59（8）：1865-1867.

7 Takemoto M，Asker N，Gerhardt H，etal.A new method for large scale isolation of kidney glomeruli from mice.Am JPathol，2002，161（3）：799-805.

8 Cui S，Li C，Ema M，et al.Rapid isolation of glomeruli coupled with gene expression profiling identifies downstream targets in Pod1 knockoutmice.JAm Soc Nephrol，2005，16（11）：3247-3255.

9 Quaggin SE，Vanden Heuvel GB，Igarashi P.Pod-1，a mesodermspecific basic-helix-loop-helix protein expressed in mesenchymal and glomerular epithelial cells in the developing kidney.Mech Dev，1998，71（1-2）：37-48.

10 Quaggin SE，Schwartz L，Cui S，Igarashi P，et al.The basic-helix-loophelix protein pod1 is critically important for kidney and lung organogenesis.Development，1999，126（24）：5771-5783.

11 Cui S，Schwartz L，Quaggin SE.Pod1 is required in stromal cells for glomerulogenesis.Dev Dyn，2003，226（3）：512-522.

12 Cui S，Ross A，Stallings N，et al.Disrupted gonadogenesis and maleto-female sex reversal in Pod1 knockoutmice.Development，2004，131（16）：4095-4105.

App lication of glomerulus purified in molecular biological research of nephrology

ZHAO Jin-yao1，DINGYan-fang1，LIU Bin1，YANG Liang1，WANG Bo2，ZHANG He-chen1，CUIShi-ying11Department of Histology and Embryology，Dalian Medical University，Dalian 116044，China
2Department of anatomy，Dalian Medical University，Dalian 116044，China

CUIShi-ying（E-mail：scui2003@dlmedu.edu.cn）

Objective：To develop a method for glomerular purification that can further perform the molecular biology for nephrology research. M ethodology：After the anesthetization，the thorax and abdomen cavity of themousewas opened.Iron oxide solution wasmicroperfused into themicrovascular circulation of the whole body that include kidneys. Kidneys were dissected and minced into small pieces，then digested with collagenase A in PBS.The tissue was diluted in PBS and gently pressed through a filter followed by rinsingwith PBS.Glomeruli that contained iron oxidewere isolated with amagnetic particle concentrator and washed with PBS.Electron microscope was used for the observation of glomerular morphology.Extracted total RNA and protein from isolated glomeruli were further employed for quantitative Real-Time polymerase Chain Reaction（qRT-PCR），miroRNAmicroarray and Western blotting experiments. Results：We developed amethod that allows largely and quickly to purify the glomerulus at different developing/developed stage from postnatal day 1 to adultmice.The structure and ultrastructure of glomerulus purified were entirely kept and normal under the electromicroscope.The total RNA and protein extracted from the glomerulus purified were successfully used to the molecular biological research，including qRT-PCR，Western blotting andmicroRNAmicroarray. Conclusion：Thismethod is simple and cheaper to purify the glomerulus，which provides a useful and powerful tool for basic science and clinic research relevant to nephrology.

glomeruli glomerular isolation iron oxide

2010-12-31

（本文编辑 春 江 青 松）

国家自然科学基金（81041051）

1大连医科大学组织胚胎学教研室（大连，116044）；2大连医科大学病理解剖教研室

崔世英（E-mail：scui2003@dlmedu.edu.cn）

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