高效液相色谱法测定定风止痛片中人参皂苷Rg1的含量*

郝桂彤，李红艳，韩振爽

(1.天津怀仁制药有限公司，天津 300385； 2.天津弗兰德医药科技发展有限公司，天津 300457)

定风止痛片主要由三七、僵蚕、防风等药组成，具有祛风化痰、行瘀散结、消肿定痛的功效，用于风痰瘀血阻络引起的关节肿胀疼痛、筋脉拘挛、屈伸不利及破伤风的辅助治疗[1]。该药物中三七具有散瘀止血、消肿定痛的功效，其主要有效成分为皂苷类[2]。本文采用RP-HPLC法测定定风止痛片中人参皂苷Rg1含量，该方法结果准确，精密度高，重现性好。

1 仪器与试药

Waters 510高效液相色谱仪(美国Waters公司)，Waters 486紫外检测器(美国Waters公司)，KQ5200B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。人参皂苷Rg1(中国药品生物制品检定所提供，批号：110703-200425)，定风止痛片(天津怀仁制药有限公司提供，批号091201、091202、091203)，乙腈为色谱纯，甲醇、乙醚和正丁醇均为分析纯，水为去离子水。

2 方法与结果

2.1色谱条件 色谱柱：Packed C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相乙睛-0.05%磷酸溶液(21∶79)，流速：1.5 ml/min，检测波长：203 nm，进样量：20 μl 。

2.2溶液制备

2.2.1对照品溶液的制备 精密称取人参皂苷Rg1对照品适量，加甲醇制成每0.5 mg/ml溶液作为对照品溶液。

2.2.3供试品溶液的制备 取本品10片，研细，精密称取细粉约4 g，置具塞三角瓶中，精密加入甲醇50 ml，称定重量，超声处理60 min，放冷，再称定重量，加甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25 ml，置蒸发皿内，水浴蒸干甲醇，残渣加水30 ml使溶解，并转移至分液漏斗中，用乙醚振摇提取2次，每次20 ml，弃去乙醚液，再用水饱和正丁醇振摇提取4次，每次30 ml，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤2次，每次20 ml，弃去氨试液，减压回收正丁醇，残渣加甲醇溶解并转移至10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.3阴性对照溶液的制备 按处方比例和工艺制备不含三七的阴性样品，并按供试品溶液的制法制成阴性对照溶液，备用。

2.3专属性考察 在上述色谱条件下，分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液各20 μl，注入液相色谱仪。人参皂苷Rg1的保留时间为22.591 min，样品色谱图中，在与对照品溶液色谱图相应保留时间处，有相同色谱峰，而阴性样品在此处无干扰，色谱图见图1。

2.4线性关系考察 精密称取人参皂苷Rg1对照品适量，配制成浓度为0.106、0.212、0.318、0.424、0.530和0.636 mg/ml的系列溶液。分别精密吸取20 μl注入液相色谱仪，以浓度(C)对峰面积(Y)进行线性回归，得回归方程为Y=7.423×105C-6.082×104(r=0.999 8)。结果表明人参皂苷Rg1在1.06～6.36 μg范围内线性关系良好。

1.人参皂苷Rg1

2.5精密度和重复性试验 取同一对照品溶液，在上述色谱条件下，连续进样6次，RSD为1.2%(n=6)。精密称取同一批号供试品6份，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下测定含量，RSD为0.67%，结果表明方法的重复性良好。

2.6溶液稳定性试验 取同一供试品溶液，在室温下放置不同时间后，分别于0、2、4、8、12、24 h时分别按上述色谱条件测定，结果表明，供试品溶液在24 h内稳定性良好，峰面积的RSD为0.68%。

2.7加样回收率试验 取同一批号(091201)已知人参皂苷Rg1含量的样品，研细，取约4 g，精密称定，6份，置具塞三角瓶中，分别精密加入人参皂苷Rg1对照品溶液，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下测定含量，计算回收率，平均回收率为99.1%，RSD为0.56%(n=6)，见表1。

表1 加样回收试验结果(n=6)

2.8样品测定 取3批样品按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20 μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。用外标法计算样品中人参皂苷Rg1的含量，分别为0.868、0.882和0.863 mg/片。

3 讨论

3.1样品处理方法选择 皂苷类易溶于甲醇及水饱和的正丁醇中，但因本品为复方，含量测定时干扰因素较多，故需先对样品进行纯化处理。参照《国家中成药标准汇编》中“复方三七胶囊”的含量测定项下有关“供试品溶液的制备方法”，先将本品细粉用甲醇超声提取，然后取一定量甲醇液蒸干，用水溶解残渣。因本品中防风、白芷和羌活均含有大量的挥发油及一些酯溶性成分，故先用乙醚萃取脱酯；然后用水饱和的正丁醇提取皂苷；用氨试液洗涤正丁醇层，以除去酸性杂质；最后蒸干正丁醇，残渣加甲醇溶解并定容，溶液用微孔滤膜滤过即可。经试验发现，此法提取效果理想，目标成分达到基线分离，且样品平均回收率为99. 1%。

3.2超声提取时间考察 分别取样品细粉3份，依次超声处理30、60和90 min，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液并进行含量测定。结果表明：样品超声处理30 min，人参皂苷Rg1提取不完全；超声处理60 min，人参皂苷Rg1的提取量即达100%，超声处理90 min与60 min比，结果无显著变化。故确定超声时间为60 min。

3.3乙醚及氨试液提取次数的确定 水溶液在用乙醚脱酯及正丁醇层在用氨试液洗涤时，第1次颜色均较重，第二次均近乎为无色，故确定乙醚和氨试液的提取次数均为2次。

3.4正丁醇萃取次数的考察 经考察，正丁醇第4次萃取液中，含人参皂苷Rg1为总含量的4.1%，第5次萃取液中，已基本检测不到人参皂苷Rg1的色谱峰，由此可知，正丁醇提取4次，已基本将人参皂苷Rg1提取完全，故确定正丁醇提取次数为4次，以免造成浪费。

1 阴健,郭力弓.中药现代研究与临床应用⑴.北京：学苑出版社，1993:33-37

2 江纪武,肖庆祥.植物药有效成分手册.北京：人民卫生出版社，1986：503-509