Smad4在非小细胞肺癌中表达的研究

闫继东,张志勇,任淑华,周立君,刘爱东

(河北省唐山市工人医院 063000)

近年来肺癌的发病率和死亡率迅速上升,位居肿瘤第1位[1-2]。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占肺癌的75%～85%。研究表明,转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)/Smad信号转导途径在肿瘤发生机制中发挥重要作用。TGF-β激活细胞膜上的Ⅰ型受体,后者进一步激活Smad家族蛋白,调节相关基因的表达。近年研究表明在Smad家族中,Smad4的表达水平与恶性肿瘤的发生发展、生物学行为及预后可能有关[3-5]。Kim等[6]发现在胃癌中Smad4阳性表达者肿瘤大多分化好、生长速度慢、预后较好。因此本文拟通过免疫组化的方法检测肺癌组织及其相应正常黏膜组织Smad4的表达,来分析Smad4在非小细胞肺癌中表达的临床意义。

1 资料与方法

1.1 标本来源 收集本市工人医院胸外科2002年1月至2004年12月非小细胞肺癌的手术患者150例作为实验组。非小细胞肺癌患者术前均未接受过任何治疗,临床和病理诊断明确。排除有风湿免疫性疾病、合并其他恶性肿瘤、有其他严重内脏器官疾病患者。其中男85例,女65例,年龄37～74岁,平均(55.2±7.1)岁。病理类型:鳞状细胞癌 99例,腺癌51例。无淋巴结转移76例,有淋巴结转移74例(有无淋巴结转移根据术后病理而定)。选取60例距肿瘤2 cm以上的癌旁肺组织作为对照组。实验组与对照组在年龄构成比较,差异均无统计学意义。术后标本均经10%福尔马林溶液固定,常规石蜡包埋备用。

1.2 实验方法 连续冰冻切片 4 μ m,用免疫组化 S-P法进行。Smad4工作浓度为1∶100,按S-P试剂盒实验步骤操作,DAB显色,苏木素复染,脱水,透明,封片。采用PBS液代替一抗作空白对照,用非免疫血清代替一抗作阴性对照。实验完成后12 h内在光镜下阅片。实验所用一抗兔抗人Smad4多克隆抗体、S-P试剂盒与DAB显示剂均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 免疫组化结果判定 Smad4主要定位于细胞浆或细胞核,胞浆中有棕褐色颗粒染色为阳性。每个切片于高倍镜下随意取5个不重复视野计数,计数所有的细胞,表达强度根据阳性细胞所占百分比进行判断,取其平均值以阳性细胞所占的百分比分为:阳性细胞小于5%为阴性;5%～＜25%为弱阳性;≥25%为强阳性。

1.4 统计学处理 实验结果均录入Excel,采用SAS8.12统计软件进行统计分析,定性资料采用χ2检验,生存分析应用单变量Logrand检验,以 P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Smad4在实验组与对照组中的表达 Smad4在实验组中表达的阳性率为33.85%,在正常对照组中表达的阳性率为75.00%,差异有统计学意义,即实验组中的阳性率明显低于对照组。见表1。

2.2 Smad4在不同分化程度非小细胞肺癌组织中表达的差异表2显示,实验组中Smad4在低分化非小细胞肺癌中表达的阳性率为16.07%,在高、中分化的非小细胞肺癌中表达的阳性率为37.23%,低分化组中表达的阳性率明显低于高、中分化组。

表1 Smad4在实验组与对照组中表达的比较

表2 Smad4在不同分化程度非小细胞肺癌组织中的表达

2.3 Smad4在有、无淋巴结转移非小细胞肺癌组织中表达的差异 由表3可见,实验组中Smad4在无淋巴结转移的非小细胞肺癌中表达的阳性率为42.11%,在有淋巴结转移的非小细胞肺癌中表达的阳性率为16.22%,二组差别有统计学意义。

表3 Smad4在有、无淋巴结转移非小细胞肺癌组织中的表达

2.4 Smad4在有、无胸膜侵犯的非小细胞肺癌组织中表达的差异 表4可见Smad4在有胸膜侵犯组中表达的阳性率明显低于无胸膜侵犯组。

表4 Smad4在有、无胸膜侵犯的非小细胞肺癌组织中的表达

2.5 Smad4在不同临床分期的非小细胞肺癌组织中表达的差异 表5显示,实验组中Smad4在Ⅲ期和Ⅳ期中表达的阳性率为15.79%,在Ⅰ期和Ⅱ期中表达的阳性率为43.24%,说明临床分期越高,Smad4表达的阳性率越低。

表5 Smad4在不同临床分期的非小细胞肺癌组织中的表达

2.6 Smad4的表达与非小细胞肺癌患者生存的关系 本组患者随访时间为8～70个月,150例非小细胞肺癌患者术后生存3年以上者87例,占58.00%。Smad4蛋白阳性组及阴性组生存率曲线如图1所示,提示非小细胞肺癌中Smad4蛋白表达与患者预后相关(χ2=18.5544,P＜0.01)。

图1 非小细胞肺癌中Smad4的表达与预后的关系(免疫组化法)

3 讨 论

Smad4被认为是一种抑癌基因,最初是作为胰腺癌的基因发现[7],现在认为其与多种肿瘤的发生发展有密切关系。有研究认为Smad4是TGF-β胞内信号转导的中心分子[8],TGF-β信号转导的受体和胞内信号转导分子Smad4等组成了一个肿瘤抑制通路,在此过程中Smad4起着瓶颈作用。Smad4突变或表达异常引起的TGF-β信号减弱或转导中断,可导致某些肿瘤细胞对TGF-β的生长抑制作用逃逸,最终导致一些肿瘤的发生[9]。

在多种肿瘤都有Smad4基因缺失、点突变或者功能性灭活[10]。本实验结果显示Smad4蛋白定位于细胞浆或细胞核,细胞浆中有棕褐色颗粒染色。Smad4在非小细胞肺癌中表达的阳性率明显低于对照组,提示Smad4参与了非小细胞肺癌的发生发展,由于正常肺组织中高表达,提示Smad4作为一种抑癌基因起作用。

从本实验结果看,Smad4蛋白在低分化非小细胞肺癌组中的表达量明显低于高、中分化组,提示Smad4参与了非小细胞肺癌的分化。李强等[11]也认为Smad4可能参与肿瘤的分化。分化作为细胞由幼稚到成熟阶段的过程,Smad4的表达异常,使其异常表达,对肿瘤的分化及进展有重要影响。由于分化程度与非小细胞肺癌的预后有一定关系,因此,此结论也间接提示Smad4与非小细胞肺癌的预后有关。肿瘤的分化即肿瘤的成熟程度,对肿瘤进行分化的诊断及判断预后一定意义,不同肿瘤细胞的分化程度在病理学诊断和治疗上是一个重要的参考数据。而肿瘤进行分化过程中,需要不同的基因及蛋白参与,因此,本实验显示了Smad4与非小细胞肺癌的分化程度相关,也提示其可能参与了肺腺癌和肺鳞癌的分化过程。即Smad4作为基因表达的蛋白质,参与到了肿瘤的分化中,但是其具体机制及调节作用尚有待进一步研究。

肿瘤的淋巴道播散是指肿瘤细胞黏附力丧失,进入淋巴管,通过淋巴道进行转移。肿瘤的淋巴道转移与非小细胞肺癌的预后密切相关,是非小细胞肺癌转移的重要途径,也是与肿瘤预后最直接的指标。本实验结果显示Smad4在有淋巴结转移组中的表达量明显低于无淋巴结转移组,提示Smad4可能参与肿瘤的淋巴道播散。Smad4是否参与了肿瘤的淋巴管生成,尚有待进一步研究证实。

非小细胞肺癌有胸膜侵犯,提示肿瘤已到了中、晚期,预后不良。本实验结果显示Smad4在有胸膜侵犯组中的表达量明显低于无胸膜侵犯组中,提示Smad4可能参与肿瘤的生长及浸润。肿瘤的生长及浸润依赖血管的生成,以使肿瘤有足够的营养供应,细胞生长繁殖。TGF-β作为血管生成因子已被认识[12],Smad4作为TGF-β传导通路中的重要调控因子在整个系统中起到瓶颈的作用,其表达降低时,使肿瘤的生长速度加快,对周围组织的侵袭和破坏增加,使其对周围组织的浸润程度增加,对胸膜的累及率增加,由于胸膜侵犯是重要的与预后相关的生物学行为,因此 Smad4的低表达,提示患者预后不良。

非小细胞肺癌的临床分期及生存分析是直接判断肿瘤预后的指标。本实验结果显示非小细胞肺癌中分期越高,Smad4表达越低,提示其可以作为判断预后的重要指标。通过生存分析,Smad4表达越低,非小细胞肺癌患者生存时间越短。但是也有不同观点,如Hiwatashi等[13]通过对121例肝细胞癌患者进行Smad4进行检测,认为 Smad4高表达与预后密切相关,因此,Smad4可能在不同器官的肿瘤中判断预后的价值不同,但是并不能否认Smad4在判断非小细胞肺癌预后中的重要价值。

总之,应用免疫组织化学技术,观察到Smad4的表达与非小细胞肺癌的生物学特征有关,今后可能对判断非小细胞肺癌的预后有一定的价值。

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