通络解毒凝胶剂薄层色谱鉴别及急性毒性的实验研究*

敖 利 陈 玲 宋 健

重庆市中医院（重庆400021）

通络解毒缓释凝胶剂是本院的自制制剂，主要用于治疗常见难治性四肢血管疾病，亦可用于治疗毒虫叮咬、烧烫伤、褥疮等皮肤损伤、感染、疮疡性疾病，具有开通经络、活血镇痛、解毒消肿的功效。为控制该制剂产品质量，本试验对其进行了薄层色谱鉴别研究，建立了黄连、马钱子的薄层色谱鉴别方法，并就用药安全性，进行了动物皮肤急性毒性试验研究。

1 材 料

1.1 仪器PBQ-I型薄层自动铺板器 （重庆南岸新力仪器厂）；AE-200型电子天平（天津METTLER公司）；UV-1型三用紫外分析仪 （上海顾村电光仪器厂）；Q-250DB型数控超声波清洗器（昆山市超声波仪器有限公司）；微量进样器（上海医用激光设备厂），HH-S11-2型电热恒温水浴锅 （上海跃进医疗器械厂），薄层层析硅胶G（青岛海洋化工集团公司）。羧甲基纤维素钠盐800-1200（国药集团化学试剂有限公司），化学纯。

1.2 试药通络解毒凝胶剂（由本院药物研究部提供，批号为20110112，原生药含量 20g/100g）。 盐酸小檗碱 （110713-200609），士的宁（110705-200306），马钱子碱 （10716-200208），马钱子（121164-200302）、黄连 （11913-200202）均由中国药品生物制品检定所提供。正丁醇、冰醋酸、甲苯、丙酮、乙醇、氨水、碘化钾、碱式硝酸铋均为AR。

1.3 动物健康成年白色家兔16只，雌雄各半，体质量2.0～2.2kg，一级合格，由重庆市中药研究院实验动物中心提供，温度（23±2）℃，湿度（60±10）%。 试验期间动物单独分笼饲养，标准饲料喂养，自由饮水与摄食。

2 方法与结果

2.1 黄连的薄层色谱鉴别

2.1.1 溶液的制备 取本品10g，置具塞锥形瓶中，加甲醇20mL，超声处理30min，滤过，滤液浓缩至10mL，作为供试品溶液。取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。取黄连对照药材粉末100mg，加甲醇10mL，加热回流15min，滤过，滤液补加甲醇至10mL，作为对照药材溶液。称取马钱子药材粉末500mg，加三氯甲烷-乙醇（10∶1）混合溶液5mL与浓氨试液0.5mL，密塞，振摇5min，放置2h，滤过，滤液作为阴性对照溶液。

2.1.2 薄层层析 照薄层色谱法［1］（2005年版《中国药典（一部附录ⅥB）》）试验，取上述 4种溶液各 10μL，分别点于同一以0.3%CMC-Na为粘合剂的硅胶G薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水（7∶1∶2）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯下（365nm）下检视。 检视：供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的黄色、绿色荧光斑点，在对照品色谱相应的位置上，显相同的一个绿色荧光斑点。阴性对照无干扰。见图1。

图1 薄层色谱图

2.2 马钱子的薄层色谱法（TLC）鉴别

2.2.1 溶液制备 取本品10g，置具塞锥形瓶中，加甲醇20mL，超声处理30min，，滤过，滤液浓缩至5mL，作为供试品溶液。取士的宁对照品，马钱子碱对照品，加三氯甲烷制成每1mL各含2mg的混合溶液，作为对照品溶液。称取马钱子对照药材粉末500mg，加三氯甲烷-乙醇 （10∶1）混合溶液5mL与浓氨试液0.5mL，密塞，振摇5min，放置2h，滤过，滤液作为对照药材溶液。阴性对照溶液：取黄连药材粉末100mg，加甲醇10mL，加热回流15min，滤过，滤液补加甲醇使成10mL，作为阴性对照溶液。

2.2.2 薄层层析 薄层色谱法［1］（2005年版《中国药典（一部附录ⅥB）》）试验，吸取上述对照品溶液、对照药材溶液、阴性对照溶液各10μL，供试品溶液20μL，分别点于同一以0.3%CMC-Na为粘合剂的硅胶G薄层板上，以甲苯-丙酮-乙醇-浓氨试液（4∶5∶0.6∶0.4）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液。检视：供试品色谱中，在与对照品、对照药材色谱相应的位置上，显相同的橘红色斑点。阴性对照无干扰。见图1。

2.3 皮肤急性毒性试验

2.3.1分组及给药 家兔分为完整皮肤受试药组，完整皮肤（赋形剂）对照组，破损皮肤受试组，破损皮肤（赋形剂）对照组，每组4只。于给药前24h，用8%硫化钠将背部脊柱两侧去毛（10%体表面积，约150cm2）。去毛后24h检查去毛皮肤无受伤。破损皮肤的制作采用灭菌注射针头将去毛消毒皮肤“#”字型划破，以轻度渗血为度。通络解毒凝胶剂取5g均匀地涂敷于动物背部脱毛区，破损皮肤则在脱毛区划破皮肤后再涂敷于受试物，并用玻璃纸和两层纱布固定。每只动物分笼饲养。敷受试物24h后，用温水去除残留受试物。去除受试药物后1、24、48、72h至第7日，每日观察并记录动物的全身中毒表现和死亡情况，包括动物体质量、皮肤、毛发、眼睛和黏膜的变化，呼吸、循环、中枢神经系统、四肢活动等变化。若有死亡动物应及时进行尸检和肉眼观察。当有肉眼可见的病变时，则需要进行病理学检查。

2.3.2 试验结果 通络解毒凝胶剂均匀涂抹动物24h，完整皮肤及破损皮肤家兔皮毛光泽正常，对家兔的饮食、行为活动、精神状态、大小便及其颜色、呼吸、鼻、眼、口腔分泌物均未造成影响。破损皮肤均在给药后2d出现点状血痂，7d内脱痂痊愈。连续观察14d亦未见异常，未出现急性毒性反应，无死亡。试验前后家兔体质量呈正常增长状态。见表1。

表1 家兔皮肤急性毒性试验前后体质量比较 （kg，±s）

表1 家兔皮肤急性毒性试验前后体质量比较 （kg，±s）

第14日破损皮肤对照组 2.30±0.02破损皮肤受试组 2.38±0.05组 别完整皮肤对照组2.55±0.19完整皮肤受试组2.45±0.13 n44 4 4第1日2.05±0.06 2.12±0.15 2.20±0.11 2.15±0.07

3 讨 论

通络解毒凝胶剂方中黄连、马钱子的主要有效成分均为生物碱［2］，因此对照品分别选用盐酸小檗碱、士的宁、马钱子碱。本薄层色谱鉴别进行了方法学研究，对供试品的制备、展开剂、薄层板、显色剂等条件进行了筛选试验。经试验，黄连的展开剂从苯-乙酸乙酯-丙醇-甲醇-水（6∶3∶1.5∶1.5∶0.3）和正丁醇-冰醋酸-水（7∶1∶2）中选用后者，马钱子的展开剂从丙酮-氯仿-浓氨水（30∶15∶1）和甲苯-丙酮-乙醇-浓氨试液（4∶5∶0.6∶0.4）中选用后者。经试验，采用本文所选方法鉴别效果好，方法简便易行，斑点分离清晰，重现性、专属性好，阴性对照无干扰。

通络解毒凝胶剂均匀涂抹动物24h，未见毒性症状表现，连续观察14d亦未见异常。实验家兔体质量增长正常。实验结束时解剖肉眼未见明显病理改变。从本品的急性毒性所试浓度以及给药后毒性表现判断，本制剂的应用是安全的。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）［M］.北京：化学工业出版社，2005：34，213.

［2］谢秀琼.中药新制剂开发与应用［M］.北京：人民卫出生版社，2002：565－570.