莪术油对鸡胚绒毛尿囊膜新生血管抑制作用研究

叶晓林，徐世军

最新研究表明，莪术油及其提取物对多种实体肿瘤如肝癌等有较强的抑制作用。同时莪术油中分离到的β-榄香烯已经作为国家二类新药用于多种肿瘤的辅助治疗，显示出较好的疗效[1]。利用鸡胚绒毛尿囊膜( chick chorioal lantoic membrane ，CAM) 研究血管生成的整体模型方法，已广泛应用于糖尿病、肿瘤等方面的研究及药物筛选 ，通过观察药物对 C A M局部新生血管的作用可以间接衡量药物对血管生成能力的影响[2]。本文以莪术挥发油为研究对象，以鸡胚绒毛尿囊膜模型为评价载体，探讨莪术油对其血管新生的抑制效果，为其进一步开发利用提供数据支持。

1 材料

莪术药材（浙江永嘉）；沙利度胺片(FYT)，（25mg/片常州制药厂有限公司，批号：09012012）。双抗，生理盐水、碘酒、酒精、吐温80，均由西南民族大学微生物实验室提供。无菌明胶止血海绵（桂林天和药业生物科技有限公司，批号20040602）。甲醇（成都市科龙化工试剂厂，批号：20090306）；丙酮（成都市科龙化工试剂厂，批号：20080128）。新鲜罗曼鸡鸡胚，取自非免疫健康鸡产受精卵，自行孵化至7～8日龄（购自四川原种鸡场）。GHP-9270隔水式恒温培养箱。

2 方法

2.1 药物制备

莪术油：水蒸馏法提取，0.5%的吐温80助溶，用无菌N.S配置成母液（浓度：23.078 gmL－1）。取母液1毫升，稀释7个梯度，取后5个梯度液。沙利度胺片：用无菌N.S配成1.75 mgmL－1浓度后，过滤除菌，加双抗，4℃冰箱保存备用。

2.2 鸡胚制备

新鲜罗曼鸡鸡胚照胚，用铅笔标识出气室和鸡胚位置。置于37℃，相对湿度60%～80%的孵箱中孵育至7～8日龄，每天用自制检卵灯观察两次，观察鸡胚的发育存活情况，筛选出发育良好，活力正常的鸡胚用于实验。

2.3 最大无毒浓度的测定

莪术油取五个梯度液即（B1、B2、B3、B4、B5），沙利度胺片溶液（阳性对照），N.S（阴性对照）。将孵育7～8天的鸡胚随机分组，3个/组。用锥子在酒精灯火焰烧灼消毒后，在气室顶端和气室下沿无血管处各钻一小孔，针头从气室下沿小孔处插入，深1.5 cm，注射0.2 mL受试药物后以石蜡封闭小孔，置孵育箱中直立继续孵育，每12小时观察一次，孵化5天。观察各组存活情况，得出最大无毒浓度B2（2.3078×10-2gmL－1）。

2.4 莪术油对鸡胚尿囊膜血管新生的影响

以B2为研究样品，倍比稀释5个梯度（D1、D2、D3、D4、D5），对照药物，分组同前进行CAM试验。开窗：鸡胚发育第8天, 灯下照蛋观察确定鸡胚位置，作好标记，暴露接种部位。植入：取药液200μL，浸入预先制备消毒好的0.2 cm3左右的明胶海绵，无菌置于鸡胚CAM，接种后封口，放回37℃培养箱中继续孵育，每12小时观察一次，孵化5天。观察明胶海绵区域血管形成情况，拍照。满足成像面积在规定的误差范围内的照片用photoshop软件将各图片读入工作区，并将其转换为灰度值图像，最后转化为B/W图像。计算血管面积值和面积比值（“白面积/黑面积”的数值，即为无血管与血管区域面积比值）。

2.5 统计学分析

数据处理采用SPSS11.5统计软件进行分析。

3 实验结果

3.1 药物对CAM血管新生的抑制作用

揭开封口膜后首先肉眼观察明胶海绵区域血管形成情况，然后用数码相机拍照，结果见图1-1～图1-3，定性评价药物对CAM血管的抑制作用。

图1-3可见，莪术油组接种部位苍白的无血管区十分明显。

3.2 鸡胚尿囊膜血管面积值和面积比值测定

3.2.1 形态学观察 空白组CAM膜与载体盘融合，部分大血管贯穿。低、中、高剂量组均出现大小血管相对分布较少的浅色斑点。低剂量组中，盘周有小血管的密集的现象，中剂量和高剂量组盘周仅有少数细小血管，以点样处为中心呈包绕或放射状分布，结果如图2-1～图2-12所示。

图像处理过程示意图:

3.2.2 结果见表2。

表2 各组鸡胚血管面积值/面积比值比较 （x¯±SD）

由表2可以看出，空白组血管面积值和面积比值较低，莪术油各剂量组该比值均较空白组显著增高，有显著的统计学意义（P<0.01），而且剂量越大，血管抑制越明显。

4 讨论

中医理论认为“阳化气，阴成形”，血管的生成依赖于气血。气血是构成和维持人体生命活动的基本物质，活血破气，导致气血难以聚合“成形”，从而抑制了新生血管。莪术属于破血逐瘀药，具有破血行气、消积止痛的功效，药性峻猛，易耗气、动血，使气血耗散，难以聚合，所以抑制了新生血管的生成。而莪术的抗新生血管作用机理的研究目前已有一些进展。20世纪70年代，Folkman[3]首先研究发现了新生血管的生成在肿瘤生长中的重要作用，开创了该领域研究的先河。他在研究中发现：肿瘤的生长和转移很大程度上依赖肿瘤血管形成。实体肿瘤长到直径 2～3 mm时，如果没有新生血管形成，肿瘤细胞即进入休眠状态，一旦血管形成，长入肿瘤组织后，肿瘤组织的血供由弥散变为灌注。冯刚[4]等通过建立动物肿瘤模型，运用莪术油予以实验治疗，结合免疫组化，检测其抑瘤率和肿瘤内血管密度以及瘤体VEGF和bFGF表达的改变，证明其对肿瘤血管形成有明显抑制作用，降低VEGF、bFGF的表达可能是其抑制肿瘤血管形成的主要机制之一。本研究显示，莪术油可剂量依赖性地抑制新生血管的作用，且效果明显，为以后进一步研究莪术的药理作用提供数据支持。

[1] 李晓华,孙毅毅.莪术油通过诱导细胞凋亡抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖[J].西部医学,2011,23(5):811.

[2] 茅彩萍,顾振纶,曹莉,等.葛根素对AGEs诱导CAM新生血管生成影响的实验研究[J].中国药理学通报,2005,21(4):420.

[3] Folkman J.What is the evidence that tumors are angiogen esis depen-dent? [J].Joumal of the National Cancer Institute,1990,82:4.

[4] 冯刚,黄涛,卢宏达,等.莪术油注射液对小鼠移植性S180肉瘤血管形成的抑制作用[J].肿瘤研究与临床,2005,17(4):233.