TCIRG1基因突变致常染色体隐性遗传性骨硬化症的临床表现及家系分析

汪 纯，何进卫，傅文贞，张 浩，顾洁梅，胡伟伟，岳 华，柯耀华，胡云秋，李 淼，刘玉娟，章振林

TCIRG1基因突变致常染色体隐性遗传性骨硬化症的临床表现及家系分析

汪 纯，何进卫，傅文贞，张 浩，顾洁梅，胡伟伟，岳 华，柯耀华，胡云秋，李 淼，刘玉娟，章振林

目的 通过对1例常染色体隐性遗传性骨硬化症 (ARO)患儿临床表型和致病基因的研究，提高临床医师对这类少见恶性遗传性疾病的认识。方法 对此例ARO患儿进行生化指标检测、腹部超声和骨骼X线检查，同时对本例患儿及其父母、祖父母和外祖父母进行T细胞免疫调节子1基因 (TCIRG1)全编码外显子测序，并以100位健康志愿者作为基因突变分析的对照。结果 该例患儿血常规示血红蛋白74 g/L，血小板24×109/L;血清碱性磷酸酶(ALP)达1 115 U/L;腹部超声检查示肝脾肿大，上肢和胸部X线可见典型的骨密度增高。患儿及其母亲和外祖母均为TCIRG1基因3号外显子第78位核苷酸发生杂合移码突变 (3705C/－)携带者。而在100例健康者中未检出该突变。结论 新发现的TCIRG1基因外显子3杂合移码突变 (3705C/－)是本例ARO患儿的致病突变位点，此基因突变导致脾肿大、严重贫血和血小板减少等严重的临床表现，因此基因检测对于诊断骨硬化症至关重要。

骨硬化症;遗传性疾病，先天性;T细胞免疫调节子1基因

骨硬化症是以破骨细胞缺乏或功能缺陷导致骨吸收障碍和高骨密度为临床特征的遗传性疾病。按照遗传方式可分为常染色体显性遗传骨硬化症 (autosomal dominant osteopetrosis，ADO)和常染色体隐性遗传骨硬化症 (autosomal recessive osteopetrosis，ARO)。其中ARO的新生儿发病率为1:250 000，主要表现为幼年起病，伴有严重且恶性的临床症状，包括危及生命的骨髓衰竭、肝脾肿大、生长迟缓和神经系统缺陷 (失明和耳聋等)。目前已经明确ARO的主要致病基因是编码破骨细胞特异性空泡型质子泵a3亚单位的T细胞免疫调节子1基因 (T － cell immune regulator 1 gene，TCIRG1)［1］、氯化物通道7基因 (Chloride channel 7，CLCN7)和骨硬化相关跨膜蛋白1基因 (Osteopetrosis－associated transmembrane protein 1，OSTM1)［2－5］。迄今中国有关ARO的报道仅见2007年由香港研究者报道的1例由CLCN7基因纯合突变 (p.I261F)导致的ARO患儿［6］。本文通过对1例由TCIRG1基因杂合突变导致的ARO患儿的报道，阐述其典型临床表现和致病基因，旨在提高临床医师对这类少见的恶性遗传性疾病的了解。

1 病例简介

患儿，女，6月龄，足月剖宫产，出生时体质量3 100 g。因严重贫血和腹部包块在上海交通大学附属第六人民医院骨质疏松和骨病专科就诊，父母为非近亲结婚，家族中无类似发病。

指标检测:接诊后对该患儿进行了生化指标检测、骨髓穿刺、腹部超声和X线检查。采集该患儿及其父母、祖父母和外祖父母的外周血并从中抽提基因组DNA，进行TCIRG1基因全编码外显子测序，共设计了10对引物，扩增了10个350～700 bp片段，覆盖了该基因19个编码外显子，上下游引物序列见表1。同时以100位健康志愿者作为基因突变分析的健康对照［7］。

表1 TCIRG1基因全编码外显子测序上下游引物序列Table 1 The forward and reverse primers for the whole exon sequencing in TCIRG1 gene

临床症状和致病基因:该患儿血常规示血红蛋白74 g/L，血小板24×109/L;血清碱性磷酸酶 (ALP)1 115 U/L(同年龄参考值为115～460 U/L)，天门冬氨酸氨基转移酶 (AST)701 U/L(同年龄参考值为18～74 U/L)，乳酸脱氢酶 (LDH)695 U/L(同年龄参考值为150～360 U/L)，羟丁酸脱氢酶(HBDH)484 U/L(同年龄参考值为72～182 U/L)，血钙2.12 mmol/L(同年龄参考值为2.20～2.70 mmol/L)，血磷0.96 mmol/L(同年龄参考值为1.23～2.00 mmol/)。腹部超声检查示肝、脾肿大。上肢和胸部X线可见典型的骨密度普遍增高，但无典型三明治样椎体和骨内骨 (bone－in－bone)表现 (见图1)。骨髓穿刺检查示粒系增生轻度减低。患儿及其母亲和外祖母均发现TCIRG1基因3号外显子78位核苷酸发生杂合移码突变 (3705C/－)导致91位蛋白质之后的氨基酸编码发生改变 (见图2)，而患儿的父亲和外祖父均为正常野生型，家系图见图3。在100例健康对照者中未发现此基因突变。

诊断:根据上述临床症状和基因突变的结果，该患儿诊断为ARO，TCIRG1基因外显子3杂合移码突变 (3705C/－)，根据人类基因突变数据库 (http://www.hgmd.org/)，此突变为新发现的ARO致病突变位点。

图1 ARO患儿左上肢和胸部X线检查所示Figure 1 X－ray radiography of the ARO infant's left upper limb and chest

图2 TCIRG1基因3号外显子78位C缺失发生杂合移码突变(3075C/－，见箭头所指)Figure 2 Genetic analysis showing the novel frameshift mutation in exon 3 of TCIRG1 gene

图3 本例ARO患儿家系图Figure 3 The pedigree of the ARO infant

2 讨论

ARO是根据遗传模式定义的骨硬化症中一种比较少见的类型，是具有严重临床表现的婴儿期常染色体隐性骨骼疾病。临床表现为再生障碍性贫血、血小板减少症、肝脾肿大、神经精神运动障碍和危及生命的骨髓衰竭。X线检查可以发现全身性的骨骼普遍硬化。TCIRG1、CLCN7和OSTM1基因是ARO的3个主要致病基因［2－5］。本文报道的患儿在6月龄时根据严重贫血、血小板减少、肝脾肿大、典型高骨密度X线表现和TCIRG1基因3号外显子78位核苷酸杂合移码突变 (3705C/－)诊断为ARO。患儿的母亲和外祖母也是此基因突变的携带者，但未发病，而其父亲为正常野生型基因。ARO是常染色体隐性遗传性骨硬化症，患者应该为该突变位点的纯合子才会发病，而在本研究中，患儿为该突变位点的杂合子。通过复习文献，有研究发现部分ARO患儿虽然是TCIRG1基因单等位基因突变的携带者，却以类似于常染色体显性遗传的方式发病［5，8－9］。对此该研究指出 Alu－介导的同源重组和杂合子水平的同一基因组大片段缺失可能是ARO患者在单等位基因突变的情况下发病的潜在机制，但这些变化是目前常规的突变检测方法所无法发现的［5］。本研究已经对患儿及其母亲进行了Alu－介导的同源重组的研究，但未发现相关证据，故推测此TCIRG1基因是该ARO患儿的致病基因，其3号外显子杂合移码突变 (3705C/－)是新发现的与ARO有关的突变位点，需要进一步的研究明确患儿携带单等位基因突变的情况下发病的机制。

本研究中ARO患儿的ALP水平高于同年龄正常参考值。由于儿童处于生长发育期，血清ALP水平可作为反映成骨细胞活性的骨转换指标，儿童的正常参考值高于成年人。通常骨硬化症被认为是一种由于破骨细胞数量或者功能缺陷导致的骨吸收障碍疾病。但是以往亦有文献报道ARO患者血清ALP水平升高［10－11］，此现象显示与其他类型的骨硬化症患者相比，ARO患者的成骨细胞分化和功能可能存在差异。而在ARO患儿骨活检中也证实发现了活跃的成骨细胞［10］。在CLCN7基因敲除小鼠中血清ALP水平上升30%也提示骨形成和骨吸收的平衡被打破［12］。近年来一些研究也证实在骨硬化症发病机制中成骨细胞可能起了一定的作用［13－15］。因此，增高的血清ALP水平可能反映了在年幼的ARO患者中成骨细胞和破骨细胞之间平衡的调节。进一步的研究需要着眼于揭示骨硬化症中成骨细胞－破骨细胞相互关系背后的病理生理机制。

综上所述，TCIRG1基因突变是中国ARO患者的致病基因之一，此基因突变可导致肝脾肿大、严重贫血和血小板减少症等严重的临床表现，因此基因检测对于诊断骨硬化症至关重要。进一步的功能研究有助于揭示此ARO患者血清ALP增高和携带单等位基因突变即发病的可能的机制。

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The Clinical Phenotypes and Family Study of Autosomal Recessive Osteopetrosis Caused by TCIRG 1 Mutation

WANG Chun，HE Jin －wei，FU Wen －zhen，et al.Metabolic Bone Disease and Genetics Research Unit，Department of Osteoporosis and Bone Diseases，Shanghai Sixth People's Hospital Affiliated Shanghai Jiaotong University，Shanghai 200233，China

ObjectiveTo study the clinical manifestations and molecular defect in an infant with autosomal recessive osteopetrosis(ARO)to improve the clinicians'understanding of this rare and malignant bone disease.Methods The biochemical parameters，abdominal ultrasound and X － ray were examined on this ARO infant.The entire coding region and adjacent splice sites of the T － cell immune regulator 1(TCIRG1)gene were amplified and sequenced directly in the patient，her parents，her paternal grandparents and her maternal grandparents.One hundred healthy donors were recruited as controls for mutation analysis.ResultsThe infant had severe anemia，thrombopenia and hepatosplenomegaly.Her hemoglobin was only 74 g/L.Her serum ALP level was 1 115 U/L.X －ray images of the chest and upper limb showed typical high bone density.A novel heterozygous frameshift mutation in exon 3 of the TCIRG1 gene(3705C/－)was detected in the infant，her mother and maternal grandmother.No controls harbored mutations in the TCIRG1 gene.ConclusionThe newly－discovered heterozygous mutation in exon 3 of the TCIRG1 gene was responsible for the Chinese infant with ARO，which clinical manifestations are severe anemia，thrombopenia and splenomegaly.So Genetic Analysis is necessary to diagnose osteopetrosis.The following functional study will investigate the potential mechanism to explain the elevated level of serum ALP and the existence of ARO in patient with monoallelic mutation.

Osteopetrosis;Genetic diseases，inborn;T －cell immune regulator 1 gene

R 681.4

A

1007－9572(2011)12－4070－03

上海市科委重大科技专题攻关专项 (10DZ1950100)，上海市科委上海市自然科学基金 (11ZR1427300)，上海市科委攻关－生物医药 (08411963100)，国家自然科学基金面上项目 (81070692)，国家自然科学基金青年项目 (81000360)

200233上海市，上海交通大学附属第六人民医院骨质疏松和骨病专科，骨代谢病和遗传研究室

章振林，200233上海市，上海交通大学附属第六人民医院骨质疏松和骨病专科，骨代谢病和遗传研究室;E－mail:zzl2002@medmail.com.cn

2011－09－05;

2011－11－03)

(本文编辑:赵跃翠)