关节炎大鼠模型血清中IL-4、IL-10表达的检测

范雪亮 肖金鱼

解放军第二五一医院（河北张家口075000）

类风湿关节炎（RA）是以四肢小关节滑膜慢性炎症为特征，伴有滑膜纤维母细胞增生，大量淋巴细胞、巨噬细胞、浆细胞浸润的一种常见的自身免疫性疾病。目前RA的发病机制尚未完全阐明，但其典型的病理学特征为滑膜组织异常增生，其中细胞因子网络失调持续作用于病变部位是导致病变侵蚀进展的主要原因之一。细胞因子通过介导细胞与细胞之间的相互作用引起组织损伤酶的释放，从而导致关节损伤，是RA炎症和关节损伤的重要介质。在诸多参与RA炎症反应的细胞因子中白细胞介素-4（IL-4）和白细胞介素-10（IL-10）是少有的抑制炎症因子，在RA类风湿关节炎发病过程中受到抑制[1]。本实验酶联免疫吸附（ELISA）技术检测佐剂性关节炎（AA）大鼠模型血清中IL-4和IL-10，以探讨其在动物模型中的表达特点。

1 材料与方法

1.1 实验动物 20只wistar大鼠，雌雄各半，体质量（150±30）g，合格证号：0172808，购于河北北方学院动物室；饲养于SPF动物实验室，全年温度21～24℃，相对湿度40%～67%。

1.2 试剂与仪器 弗氏完全佐剂购于美国Sigma公司；大鼠IL-4和IL-10 ELISA试剂盒均为美国Headquarters公司产品。TDL80-2B离心机，EL301strip reader酶标仪购于自美国Bio Tek公司。756MC型紫外可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司产品。

1.3 分组与造模 30只wistar大鼠随机分成对照组（10只）、模型组（20只）。造模根据文献[3]方法加以改进，正常条件饲养10d后，将弗氏完全佐剂摇匀后，按0.1mL/只注于模型组大鼠右后肢足跖内造模。

1.4 病理组织学检查 造模30d后取模型组5只大鼠的踝关节，经固定、脱钙石蜡包埋、切片后行苏木精-伊红（HE）染色。光镜下观察局部组织病理学变化。

1.5 影像学检查 造模20d后取5只大鼠（用苦味酸做标记），每只大鼠腹腔注射10%水合氯醛3.5mL/kg麻醉，行大鼠四肢关节X线摄片，观察关节破坏情况。30d后在取相同大鼠重复操作，观察关节破环情况。

1.6 模型评价 大鼠生长情况：普通实验天平称体质量，造模前称1次，造模后每两日测量1次，记录动物生长情况。同时仔细观察动物的毛色、精神状态及关节症状的变化。大鼠关节足肿胀：注射弗氏完全佐剂后，用容积法排水法测量双后肢的足肿胀度。造模前观察1次，后每周观察1次，观察足爪肿胀情况。同时对其他3只足爪炎症进行评分。采用4分制的评分标准，每只大鼠的最高分为16分，记录并比较20d时，对照组和造模组关节炎指数和双后肢足肿胀度平均值差异。IL-4、IL-10含量：用10%水合氯醛（3.5mL/kg）麻醉大鼠，开胸使心脏暴露，进行心脏取血，全血2500r/min离心20min，取血清-20℃保存备用。检测IL-4、IL-10，具体操作按ELISA试剂盒说明进行。

2 结 果

2.1 一般情况 模型组大鼠体质量明显减轻，关节红、肿，以对称性后肢关节为主，累及踝关节、膝关节、趾间关节等。20d左右出现第1个炎症高峰，然后红肿有一定程度消退；30d左右达到第2个高峰，进入慢性期，红肿逐渐消退逐渐出现关节强直、畸形以至功能障碍，表明慢性、对称性、多发性关节炎发生。

2.2 大鼠模型双后肢足肿胀度 见表1。实验第14日，大鼠关节开始出现肿胀，而后足首先出现红肿，后逐渐延伸至前足并日趋严重，20d肿胀达到最高值后逐渐减轻，模型组与对照组大鼠比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 两组组大鼠双后肢足肿胀度比较 （±s）

表1 两组组大鼠双后肢足肿胀度比较 （±s）

与对照组比较，*P＜0.05。 下同。

组 别 n 关节炎指数 关节体积（cm3）对照组 10 0.90±0.73 7.15±0.23模型组 10 7.29±1.82* 13.81±1.63*

2.3 大鼠模型双后肢X线表现 X线片显示模型组大鼠以双后肢改变为主，20d时隐约可见骨质疏松，关节间隙模糊，30d时X线片可见明确的关节间隙模糊、变窄。 而对照组大鼠双踝关节同时点比较，变化不大，无明显骨质疏松、关节间隙清晰、未见骨质破坏。

2.4 大鼠模型炎性足爪组织病理学改变 造模30d后，模型组大鼠节腔滑膜层次增多可达6～8层，甚至10余层，且排列不规整，滑膜内有大量炎性细胞浸润，以单核细胞和淋巴细胞为主，且在关节软骨附近有血管翳形成，引起关节软骨和骨组织破坏。

2.5 大鼠模型外周血IL-4和IL-10的表达 见表2。模型组IL-4和IL-10水平较对照组均明显降低，两组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

表2 两组大鼠炎性细胞因子水平比较 （ng/L，±s）

表2 两组大鼠炎性细胞因子水平比较 （ng/L，±s）

组别 n IL-4 IL-10对照组 10 124.82±16.77 59.00±16.85*模型组 10 67.00±8.55* 29.11±27.59*

3 讨 论

IL-4能调节多种不同类型细胞的活性，抑制TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8等炎症因子的活性，控制炎症反应。IL-4通过提高mRNA的降解率来抑制促炎性细胞因子的合成；IL-4还有保护软骨和关节下骨及其他关节组织完整性的作用，主要通过减轻由INF、IL-1和LPS造成的蛋白多糖的破坏而起作用[2]。另外，IL-4能上调IL-1Ra的产生，刺激单核细胞/巨噬细胞和中性粒细胞产生可溶性Ⅱ型IL-1R、可溶性 TNF；同时IL-4可减少单核细胞MHC分子和共刺激分子的表达、NO的合成、PGE2的产生。IL-4能使Th1/Th2型细胞发生转移和引导B细胞产生IgG1、IgG4、IgE 抗体，还可协同 IL-10 抑制 Th1 细胞反应[5]。 这些现象表明，IL-4在RA的发病过程中通过抑制细胞反应和抑制促炎性细胞因子而起抗炎作用。IL-10通过抑制核因子κB进而抑制 Th1细胞产生 TNF-α、IL-2、IFN-γ；IL-10可降低单核细胞HLA-DR抗原和 B7等协同刺激分子的表达，抑制Th1细胞介导的淋巴细胞活性；抑制NO合成和PGE2产生[6]。在正常情况下，炎症因子和抗炎因子处于一个平衡状态，如有外界原因使抗炎因子的分泌减少，打破这种平衡，则会引发类风湿关节炎，所以一些能够促进抗炎因子分泌的药物也成了研究热点。本实验通过对大鼠AA模型的制备及对对照组和模型组大鼠关节炎症积分、影像学、病理学等相关指标的评估，进一步探讨了IL-4和IL-10在AA模型中的表达特点。结果表明IL-4和IL-10大鼠模型中的表达受到了抑制，这与其在RA患者中的相关表达特点相类似。作为在RA中大量存在的T细胞来源的细胞因子IL-4和IL-10可能成为评价RA病情和治疗疗效的两个最重要免疫学指标。总之，对IL-4和IL-10的深入研究必将有助于对RA发生机制的进一步认识，合理地评价RA的病情进展，为RA治疗，包括药物及免疫治疗提供更加科学的实验依据。

[1]刘慧招，沈敬华.类风湿关节炎免疫机制的研究进展[J].内蒙古医学杂志，2008，40（3）：327-329.

[2]Wirjatijasa F，Dehghani F，Blaheta R A，et al.Interleukin-4，interleukin-10，and interleukin-1-receptor antagonist but not transforming growth factor-beta induce ramification and reduce adhesionmoleculeexpressionof ratmicroglialcells[J].JNeurosciRes，2002，68（5）：579-587.

[3]Vanroom JAG，Lafeber FP JG，Bijlsma JW J.synergistic activety of interleukin-4 and interleukin-10 in suppression of inflammation and joint destruction in rheumatoid arthritis[J].Arthritis Rheum，2001，44（10）：3-12.

[4]Fermandes JC，Martel-pelletier J，Pelletier JP.The role of cytokines in osteoarthritis pathophysiology [J].Biorheology，2002，39（12）：237-246.