抗骨增生片对兔骨关节炎滑膜病理形态及uPA、uPAR表达的影响*

尹学永 谷宁飞 王志文 马敬习 于 杨

1河北省秦皇岛市第二医院（河北秦皇岛066600）2天津中医药大学（天津300193）3河北省安国市医院（河北安国071200）4河北联合大学中医学院（河北唐山063000）

抗骨增生片具有补肾、活血、止痛之功效，临床应用治疗骨关节炎取得满意疗效。此研究通过建立兔实验性膝骨关节炎模型，观察抗骨增生片对其滑膜病理组织形态及尿激酶型纤溶蛋白酶原激活物（uPA）及其受体（uPAR）表达的影响，以探讨该药治疗膝骨关节炎是否与减轻滑膜损害、降低二者的表达有关。

1 材料与方法

1.1 药物与动物 抗骨增生片：通化华夏药业有限公司生产；成分：熟地黄、鹿衔草、骨碎补（烫）、淫羊藿、肉苁蓉、鸡血藤、莱菔子（炒）；批准文号为国药准字Z22023683。雄性日本大耳白兔30只，体质量（2.50±0.150）kg。 于室温分笼饲养，按顿供给标准饲料（由华北煤炭医学院实验动物中心提供），自由活动、饮水。

1.2 试剂与仪器 木瓜蛋白酶购自天津市诺奥科技发展有限公司，活力200万U/g；uPA、uPAR免疫组化试剂盒均购自武汉博士德试剂公司；石蜡组织切片机，天津天利航空机电有限公司；光学显微镜，BX50型，日本OLYMPUS公司生产。

1.3 分组与造模 健康雄性日本大耳白兔30只，适应性喂养1周后随机分为正常对照组、模型对照组，抗骨增生片组。每组各10只。参照文献[1]方法，用氯氨酮肌肉注射（10mg/kg）麻醉动物后，模型对照组和抗骨增生片组均于右膝关节处剔毛，碘伏消毒，将关节轻弯，经髌腱内侧进针，关节腔内注射1.6%木瓜蛋白酶生理盐水溶液0.5mL，隔3d注射1次，共注射3次。期间动物用标准饲料正常饲养。

1.4 给药方法 造模结束后24h开始给药。抗骨增生片组按成人每日每千克体质量用药量的6倍剂量作为大耳白兔的等效剂量[2]（抗骨增生片 0.36g/kg），药物溶于 10mL 生理盐水中灌胃，每日1次；正常对照组和模型对照组灌胃等量生理盐水。给药4周。

1.5 标本采集及检测 于末次给药后24h以气栓法处死动物，沿右侧膝关节正中纵行切开皮肤直至暴露出以膝关节为中心约3cm×3cm的区域，以齿镊提起髌骨，沿髌骨上缘约0.3～0.4cm处向下切割直至髌骨，再分别沿髌骨两侧向下分离至胫骨，此时即打开了右侧膝关节腔，可见由髌骨下缘向上延续的滑膜组织。完整剥离滑膜组织，最后以眼科镊轻轻夹住其游离端，用刀片完整切下。标本用新鲜配制10%中性甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片。每个标本制作3张切片，一张进行苏木素和伊红染色光镜观察，做病理形态学分析；另两张作免疫组化测定。以滑膜组织病理形态学积分，uPA、uPAR阳性细胞个数对数据进行量化。

1.6 统计学处理 应用SPSS 11.5统计软件。计量资料以（±s）表示。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 光镜下滑膜组织形态 正常对照组：滑膜细胞单层，形态扁平，薄膜样，半透明，无血管增生，无纤维化，无乳头状增生，偶见炎细胞、巨噬细胞。模型对照组：滑膜组织明显充血、水肿，表现为小血管增多、扩张，充满红细胞，间质疏松，有较多炎性细胞浸润、纤维细胞增生，有血管翳形成，滑膜细胞增生成多层，呈乳头状，其下方出现明显的巨噬细胞样肉芽肿性病变。抗骨增生片组：滑膜肿胀、充血程度及较模型对照组明显减轻，滑膜细胞增生亦较模型对照组轻，未见明显炎细胞浸润及血管增生，巨噬细胞样肉芽肿性病变及间质纤维化不明显。

2.2 滑膜病理积分 参照巫桁锞等[3]滑膜病理评分标准对各组兔关节进行评分。抗骨增生片组及模型对照组滑膜组织病理形态各单项积分及总积分高于正常对照组（P＜0.01），抗骨增生片组滑膜组织病理形态各单项积分及总积分明显低于模型对照组（P＜0.05）。 结果见表 1 。

表1 各组滑膜病理形态单项积分比较 （分，±s）

表1 各组滑膜病理形态单项积分比较 （分，±s）

与正常对照组比较,▲P＜0.01;与模型对照组比较,△P＜0.05。下同。

组别 n 炎性细胞浸润正常对照组 10 0.45±0.28模型对照组 10 2.35±0.63▲抗骨增生片组 10 2.30±0.48▲△纤维组织增生0.75±0.68 2.60±0.40▲2.25±0.68▲△滑膜组织增生 巨噬细胞增生 总积分0.40±0.39 0.55±0.50 2.95±1.42 2.50±0.41▲ 2.55±0.50▲ 10.40±0.77▲2.20±0.42▲△ 2.10±0.52▲△ 9.20±1.06▲△

2.2 各组uPA、uPAR阳性细胞表达比较 各组的滑膜衬里层细胞、滑膜下层单核细胞、巨噬细胞样细胞、多型核白细胞以及内皮细胞均出现uPA和uPAR的表达，在抗骨增生片组及模型对照组滑膜组织中的表达强度高于正常对照组（P＜0.01），抗骨增生片组滑膜组织中的表达强度明显低于模型对照组 （P＜0.05）。 结果见表2。

3 讨 论

尽管骨关节炎（OA）病因复杂并存在争议，但总伴有不同程度的滑膜炎症。在诸多因素引起的软骨退变过程中，滑膜的炎性介入是加速软骨退变且诱发临床症状的重要因素之一。有研究证明，膝骨关节炎可表现为滑膜水肿、血管扩张，滑膜细胞分泌异常旺盛、功能活跃，关节腔内积液增多，压力增大，使循环受阻，局部代谢产物堆积[4]。如此循环往复，致使滑膜逐渐增厚、纤维化、粘连，滑膜中uPA，uPAR增高，加剧滑膜炎症，并可直接释放入关节液中，与各种细胞因子间相互作用，使得滑膜炎症迁延，并激活软骨中的纤溶酶原，被激活的纤溶酶可引起关节软骨基质的降解，导致关节软骨的进行性破坏[5-6]，从而形成恶性循环，影响膝关节的正常活动，加重OA症状。

表2 各组uPA、uPAR阳性细胞表达比较 （±s）

表2 各组uPA、uPAR阳性细胞表达比较 （±s）

组 别 n uPA uPAR正常对照组 10 2.60±1.26 2.40±1.35▲模型对照组 10 33.30±4.22▲ 33.5±5.32▲抗骨增生片组 10 29.10±4.93▲△ 24.6±5.64▲△

OA属于中医学“骨痹”、“痛痹”等范畴，其发病与年老肝肾亏虚、外感风寒湿邪密切相关，最终导致关节气血、痰瘀凝滞而发病，属本虚标实之证。肝肾亏虚、瘀血阻滞是骨痹发生的病机关键。抗骨增生片组方精炼、简而力专。方中熟地黄、骨碎补、淫羊藿、肉苁蓉具补肾益精、填髓壮骨之效，鸡血藤、鹿衔草、莱菔子具理气活血、祛风除湿之功，组方切合骨痹肾虚、血瘀之病机，临床应用能有效缓解膝骨关节炎疼痛、晨僵，消除关节肿胀，恢复关节功能，延缓病情的进展。

实验结果显示，经木瓜蛋白酶关节腔注射造模后滑膜组织明显充血、水肿，均出现了病理性损坏。抗骨增生片给药后滑膜充血、肥厚减轻，病理积分与模型组比较明显下降，具有显著差异。治疗后滑膜中uPA、uPAR的阳性表达降低。

综上分析，抗骨增生片治疗OA可能与以下机制有关：通过抑制滑膜炎症，减少滑液分泌量，从而减少滑膜细胞炎性细胞因子的分泌，减轻其对关节软骨的破坏；该药的有效成分与uPA上的酶结合位点相结合而降低其表达，或能够直接抑制滑膜细胞合成分泌uPA和uPAR而使其含量下降，降低关节软骨基质的降解；改善膝关节组织血液循环并清除炎性细胞对软骨的损伤等因素而改善关节软骨正常的内环境，促进滑膜细胞及细胞外基质的修复，起到防治OA，延缓软骨退行性改变的作用。

[1]Kitoh Y，Katsuramaki T，Tanaka H，etal.Effect of SL-1010 （Sodium hyaluronatewith highmolecularweight）on experimentalosteoarthritis induced by intra-articularly，applied papain in rabbits [J].Folia pharmacol japon，1992，100（1）： 67-76.

[2]孙敬方.动物实验方法学[M].北京：人民卫生出版社，2002：357.

[3]巫桁锞，李荣亨，钟玉.复元胶囊对兔膝骨关节炎滑膜形态影响的实验研究[J].中国中医急症，2010，19（5）：823.

[4]左晓霞，陶立坚，高洁生主译.凯利风湿病学[M].7版.北京：人民卫生出版社，2006：1276.

[5]Li MQ，Shi CH，Li KX，et al.Expression of uPA，uPAR，tPA in osteoarthritis synovialmembrane and the significance[J].The Orthopedic JournalofChina，2004，12（21）：1686-1688.

[6]王万春，王跃，孙材江.骨关节炎滑膜中尿激酶型纤溶酶原激活物及其受体蛋白的表达[J].湖南医科大学学报，2001，26（3）：257-260.