兔抗猪血凝性脑脊髓炎高免血清及IgG的制备

2011-06-12 08:00常灵竹苗丽娟
饲料博览 2011年12期
关键词:猪血脊髓炎效价

常灵竹,苗丽娟

(吉林农业科技学院,吉林 吉林 132101)

猪血凝性脑脊髓炎是由猪血凝性脑脊髓炎病毒(HEV)引起仔猪的一种急性、高度接触性传染病。临床上以仔猪呕吐、衰竭或明显的神经症状为主要特征[1]。主要侵害3周龄以下的乳猪,病程约10日,被感染仔猪的发病率和致死率都可达100%,成年猪呈隐性感染。该病目前尚无特效疗法和有效疫苗,多数流行地区处于呼吸道亚临床感染状态。母源抗体可保护仔猪不受该HEV的侵害。未获得母源抗体的仔猪,可在初生后注射高免血清建立被动免疫[2-7]。诊断和治疗用血清所含的抗体主要为IgG,而IgG在疾病诊断治疗方面的应用越来越广泛,制备高纯度的抗体显得尤为重要。本试验拟利用家兔制备抗猪血凝性脑脊髓炎的高免血清,并利用高免血清制备和提纯IgG。

1 材料与方法

1.1 试验动物

家兔购自吉林大学实验动物中心。

1.2 细胞和病毒

HEV和猪肾细胞(PK-15细胞)由吉林大学病理实验室提供。

1.3 HEV的培养与纯化

采用单层吸附接毒法繁殖HEV,用10%的MEM培养PK-15传代,待细胞长成单层后,倾弃营养液,加入HEV,37℃吸附1 h,然后加入2%维持液,置于37℃5%CO2的细胞培养箱中培养,待细胞出现>80%的病变时,将细胞培养瓶放入冰箱中,经反复冻融2~3次后,将细胞液集合在同一个固定的容器中,置于-20℃保存备用[8]。最后将大量收取的病毒液溶化,将病毒液放入到无菌的离心管中,6000 rpm、4℃离心30 min,取上清,再用20000 rpm、4℃离心3 h,收集病毒沉淀,用TNE溶解,用0.22 μm滤膜过滤,保存于-80℃备用。测定纯化后HEV感染力的滴度,根据Reed-Muench方法计算HEV的TCID50[9]。

1.4 兔抗HEV阳性血清的制备

猪血凝性脑脊髓炎病毒细胞培养物经纯化后,56℃灭活30 min,灭活后的病毒对家兔进行3次免疫,首次加入弗氏完全佐剂,以后两次加入弗氏不完全佐剂,佐剂与病毒的比例为1∶1。免疫2只家兔,每只500 μL·次-1(103.4TCID50·100 μL-1),每次间隔14 d,用ELISA方法鉴定血清是否为阳性[10]。

1.5 抗体的亲和层析纯化

1.5.1 饱和硫酸铵粗提IgG

在血清中先加入等体积的PBS,搅拌混合均匀,再缓慢滴加相同体积的饱和硫酸铵,边滴加边搅拌,完全混匀后,室温静置1 h(或4℃过夜),10000 rpm离心10 min,收集沉淀,用少量的PBS溶解沉淀,然后装入透析袋内,置于20倍体积的PBS(pH 8.0)中,4 ℃ 透析2 d,每天换液2次[11]。收集脱盐后的抗体溶液,用0.22 μm滤膜过滤,备用。

1.5.2 蛋白A亲和层析纯化IgG

首先将蠕动泵、收集器、核酸蛋白测定仪与层析柱相连;用0.1M pH 8.0的磷酸缓冲液平衡柱床;然后加入经饱和硫酸铵粗提的IgG,室温作用15 min,用0.1M pH 8.0磷酸缓冲液充分淋洗至淋洗液OD值<0.02。用醋酸-醋酸钠洗脱缓冲液洗脱所结合的IgG,收集3 mL于离心管中,应用LM17型记录仪记录检测。先用0.1M pH 8.0磷酸缓冲液平衡柱床,再用20%的乙醇平衡柱床。将收集的液体装入透析袋内,置于PBS溶液中,4℃透析过夜。次日将透析袋取出,10000 rpm离心15 min,收集上清,用ELISA方法检测血清抗体效价,保存备用。

分别取血清和纯化后的IgG 0.01 mL作为样品,分别加入2倍SDS上样缓冲液与样本1∶1混合,煮沸10 min,进行SDS-PAGE电泳,凝胶染色-脱色后,根据血清和纯化后的IgG的蛋白含量,判断其纯化效果[12]。

2 试验结果

2.1 TCID50测定结果

根据Reed-Muench方法计算HEV的TCID50,结果纯化后HEV的滴度为103.4TCID50100 μL-1。

2.2 兔抗HEV高免血清的效价

在第3次免疫后第7 d采血,用ELISA方法测定兔抗HEV血清效价,效价测定结果为1∶12800,符合试验要求,采血并分离血清。

2.3 IgG的纯化结果和效价

经过亲和层析纯化得到的兔抗HEV IgG,根据电泳结果可明显看到两条带,一条为IgG的重链,另一条为IgG的轻链,见附图。用ELISA方法测定兔抗HEV IgG的效价为1∶50000。

3 讨论

试验用ELISA方法测定兔抗HEV血清效价,测定结果表明,所制备的血清效价较高,可达1∶12800;根据SDS-PAGE电泳结果可明显看到两条带,一条为IgG的重链,另一条为IgG的轻链,没有其他杂带,说明使用亲和层析得到较高纯度的IgG,经ELISA方法测定兔抗HEV IgG的效价高达1∶50000,比未纯化前的血清效价提高390%。IgG主要是由浆细胞产生的,是哺乳动物血清中主要的免疫球蛋白,约占血清免疫球蛋白总量的75%。IgG在血液中含量高,维持时间长,对构成机体的免疫力起着重要作用;当体内缺乏IgG时,常易患化脓性感染,导致病原微生物经血流扩散。诊断和治疗用血清所含的抗体也主要为IgG,因此制备高纯度的抗体显得尤为重要。要提纯IgG必须利用化学方法从血清中除去血清白蛋白,沉淀出血清γ球蛋白,进而用透析和过滤的方法去除血清γ球蛋白中的盐类物质,得到免疫球蛋白,然后利用这些蛋白质的分子量和理化性质的差异对IgG进行纯化。目前,纯化抗体的方法很多,有辛酸-硫酸铵法、盐析法、凝胶色谱法、离子交换法、亲和层析等。但由于纯化方法不同抗体的效率不同,甚至同一种方法对于不同抗体的效果也存在差异[13-15]。蛋白A亲和层析纯化的抗体纯度高,且蛋白A具有良好的再生性,耐受低pH,可反复利用,长期不用时用含适量叠氮钠的中性缓冲液平衡后,置于4℃保存即可[16]。本研究选取硫酸铵-蛋白A亲和层析法对IgG进行了纯化,得到了高纯度和高效价的IgG。

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