几种常用杀虫剂对瓜蚜的毒力和对乙酰胆碱酯酶的抑制作用

于永成, 刁青云, 李海平*

(1.内蒙古农业大学农学院,呼和浩特 010019;2.中国农业科学院蜜蜂研究所,北京 100093)

瓜蚜(Aphis gossypii Glover)又称棉蚜,广泛分布于全世界,是为害瓜类、豆类和棉花等多种农作物的主要害虫之一,其中以棉花和瓜类受害最重[1]。瓜蚜是典型的r-害虫,发育历期短、生殖力高、世代重叠。在适宜的温室环境条件下,瓜蚜大量繁殖,天敌等自然控制因素往往无法控制瓜蚜种群的增长,需要使用农药才能控制其危害[2]。由于长期使用有机磷类、氨基甲酸酯类、拟除虫菊酯类杀虫剂防治瓜蚜,导致瓜蚜产生抗药性,药剂的防效明显下降[3-4]。大量研究证明,乙酰胆碱酯酶(AChE)不敏感性是昆虫对有机磷类药剂产生抗性的主要机制[5]。为了明确4种常用杀虫剂氧乐果、辛硫磷、三唑磷、吡虫啉对呼和浩特当地温室中瓜蚜的毒力及有机磷杀虫剂对瓜蚜AChE的抑制作用大小,作者采集呼和浩特市郊蔬菜基地黄瓜温室内瓜蚜开展了本项研究,为田间更好地控制瓜蚜的危害提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 供试蚜虫

瓜蚜采集于呼和浩特市郊蔬菜基地黄瓜温室内,挑选个体大小、发育状况相对一致的无翅蚜,一部分直接用来做生物测定,另一部分放入超低温冰箱内冷冻,做酶的测定分析。

1.2 供试药剂及仪器

碘化硫代乙酰胆碱(acetylthiocholineiodide,ATCh),(Sigma公司);5,5′-二硫双硝基苯甲酸(5,5′-dithio-bis-2-nirorbenzoic acid,DTNB),(Fluka 公司);T ritonX-100,(Sigma公司);考马斯亮蓝 G-250,(Fluka公司);毒扁豆碱(Sigma公司);79.1%氧乐果原药,90%辛硫磷原药,80.5%三唑磷原药,94%吡虫啉原药(山东济南世帮农化公司提供);其他化学试剂均为国产分析纯。

冷冻离心机(Hettich,universal 32R,Japan);紫外可见分光光度仪(T U-1810),北京普析通用仪器有限责任公司产品;电子天平(Sartorius 2004MP),Opton公司产品;恒温水浴锅,上海科技器材有限公司生产。

1.3 生物测定

参照Moores等的叶片药膜法测定[6]。将农药原药稀释成所需的6个浓度梯度,放入烧杯中。将室内种植的没有接触过药剂的黄瓜叶片浸入药液中,10 s后取出,在阴凉处晾干后把叶柄用脱脂棉保湿,放入培养皿中,用毛笔小心将采集的蚜虫接到叶片上,每浓度至少接 30头,重复 3次,放入25℃的恒温培养箱内,24 h后检查死亡数。以毛笔轻轻碰触,虫体不动计为死亡。数据用Polo软件处理,计算出 LC50和斜率b。

1.4 AChE酶液制备

取瓜蚜40头,加入1 mL预冷的0.1 mol/L的磷酸缓冲液(pH7.3,含0.1%TritionX-100),在冰浴条件下匀浆。匀浆液于4℃,10 000 g离心15 min后取上清液,抽滤后备用。

1.5 AChE比活力测定

采用高希武的方法[7],略有改动。取待测酶液0.1 mL与0.1 mL ATCH混合,30℃水浴锅中保温10 min后,加入1.8 mL DTNB显色剂显色并终止反应,然后于 412 nm下测定 A412nm值,计算AChE的比活力。比活力计算公式为：

AChE比活力=(ΔA412 nm/mg×V)/ε×L

其中,V为反应总体积(mL),ε为酶与底物反应的产物和DTNB络合物的摩尔消光系数,值为13 600 L/(mol◦cm),L为比色杯的光程,酶比活力单位为μ mol/(min◦mg)。

1.6 农药对瓜蚜AChE的体外抑制作用

以丙酮溶解农药原药制成母液,使用前用pH 7.3、0.1 mol/L的磷酸缓冲液将毒扁豆碱和氧乐果、三唑磷、辛硫磷原药稀释成不同浓度(浓度范围为10-3～10-8mol/L)。反应时先在反应管中加入不同浓度的抑制剂和酶液混合,保温10 min后,加入底物(ATCh),测其残留的AChE活性。对照管以缓冲液代替抑制物。每个药剂至少5个浓度,每个浓度3次重复。抑制率计算公式：

酶的抑制率=(对照A-处理A)/对照A×100%。

1.7 AChE时间抑制动力学曲线

将制备好的酶液分别与不同浓度的抑制剂混合后,在30℃的水浴锅中保温,每隔1 min将此混合物取出0.1 mL加入已经盛有0.1 mL底物的反应管中,反应15 min后加入1.8 mL显色剂(DTNB)显色并终止反应,测其A值。共检测10个点,3次独立重复。抑制剂分别为毒扁豆碱和其他3种有机磷类药剂氧乐果、辛硫磷、三唑磷,前者终浓度为1×10-6mol/L,后者终浓度为1×10-5mol/L。

1.8 酶原蛋白含量测定

参照Bradford考马斯亮蓝G-250法[9],用牛血清白蛋白(BSA)测定蛋白质含量,绘制标准曲线。

2 结果与分析

2.1 4种农药对瓜蚜的室内毒杀效果

吡虫啉是近几年才开始在呼和浩特地区温室使用的杀虫剂之一。表1显示了吡虫啉和3种有机磷杀虫剂对瓜蚜的室内毒力。测定结果表明,吡虫啉对呼和浩特地区瓜蚜的致死中浓度仅为4.203 mg/L,三唑磷相对于吡虫啉的相对毒力指数为10.30倍。氧乐果虽然长期使用,但其LC50值为21.698 mg/L,相对吡虫啉的毒力指数为5.16倍。4种杀虫剂对瓜蚜的毒力依次为：吡虫啉＞氧乐果＞辛硫磷＞三唑磷。

表1 4种杀虫剂对瓜蚜的室内毒力

2.2 3种有机磷杀虫剂抑制瓜蚜AChE活性的剂量效应

图1显示了毒扁豆碱和3种有机磷杀虫剂对瓜蚜体内AChE活性抑制的剂量效应。由图可以看出,3种有机磷杀虫剂对瓜蚜体内AChE活性抑制的趋势一致,都随着剂量的下降而抑制率急剧下降。相比较而言,毒扁豆碱对瓜蚜AChE活性抑制比较平缓。

图1 毒扁豆碱和3种有机磷杀虫剂抑制瓜蚜体内AChE活性的剂量效应

抑制中浓度(I50)通常表示酶对抑制剂的敏感度,I50值越大,说明酶对抑制剂越不敏感,反之越敏感。从三唑磷、辛硫磷和氧乐果对瓜蚜离体AChE的I50值比较可看出(表2),氧乐果对瓜蚜离体AChE的抑制中浓度最小,I50仅为9.6×10-6mol/L,瓜蚜AChE对氧乐果最敏感,其次为辛硫磷和三唑磷。

表2 毒扁豆碱和3种有机磷杀虫剂对瓜蚜AChE离体抑制中浓度

2.3 毒扁豆碱和3种有机磷杀虫剂抑制瓜蚜AChE的时间进程曲线

毒扁豆碱是AChE的专性抑制剂,图2显示了毒扁豆碱和3种有机磷杀虫剂对瓜蚜AChE的时间抑制进程曲线。结果表明,毒扁豆碱对瓜蚜离体AChE的抑制速度最快,1 min就达到50%,之后随着时间增加,抑制率逐渐增强。其他3种有机磷杀虫剂对瓜蚜离体AChE的抑制速度相对较慢,1 min时抑制率仅为10%左右,但随着时间的延长,抑制率增加很快,到10 min时,氧乐果和辛硫磷基本与毒扁豆碱抑制率相同。

图2 毒扁豆碱和3种有机磷杀虫剂在不同时间间隔对瓜蚜AChE活性的影响

3 讨论

瓜蚜在全国各地都有分布,各地由于经济水平发展的差异,用药水平的差异也非常大,因此各地瓜蚜对常用药剂的抗药性情况也不尽相同。

氧乐果是有机磷杀虫剂中使用时间较长的药剂,由于其具有内吸性,常被用来防治蚜虫、木虱、红蜘蛛等刺吸式口器的害虫。但关于瓜蚜对氧乐果的抗性报道却很少。吴世昌等测定了上海地区常用杀虫剂对瓜蚜的毒力[3],瓜蚜对氧乐果已经产生了中等程度的抗性,在上海地区需要限制氧乐果使用。而本试验中,氧乐果对瓜蚜的LC50仅为21.70 mg/L,瓜蚜对氧乐果还比较敏感,可以和其他药剂交替使用。

吡虫啉是近几年才开始使用的杀虫剂之一,主要用来防治刺吸式口器的害虫。但近几年国内外已经有不同种类蚜虫对吡虫啉产生抗药性的报道[10-13]。而关于瓜蚜对吡虫啉的抗性情况至今还没有报道。路虹等测定了吡虫啉对瓜蚜的毒力[14],致死中浓度LC50为9.674 mg/L,本试验中吡虫啉对瓜蚜的致死中浓度LC50为4.20 mg/L,说明目前在呼和浩特地区,瓜蚜对吡虫啉还处于敏感阶段,可以作为防治选择的药剂之一。

乙酰胆碱酯酶是有机磷及氨基甲酸酯类杀虫剂的主要作用靶标,乙酰胆碱酯酶被杀虫剂抑制后,正常的神经传导被阻断,而神经传导的阻断必然会影响整个生理生化过程的失调与破坏,最终造成昆虫的死亡[15]。试验中3种有机磷杀虫剂均能显著抑制瓜蚜体内乙酰胆碱酯酶的活性。刘红霞等研究了几种抑制剂对花翅摇蚊体内乙酰胆碱酯酶的抑制[16],氧乐果对花翅摇蚊体内乙酰胆碱酯酶的抑制中浓度为9.42×10-6mol/L,本试验中氧乐果对瓜蚜体内乙酰胆碱酯酶的抑制中浓度为 9.6×10-6mol/L,两者的结果类似。王莹等研究了辛硫磷和三唑磷对枸杞木虱乙酰胆碱酯酶活性的抑制作用[17],其中对木虱成虫乙酰胆碱酯酶活性的抑制中浓度三唑磷大于辛硫磷,与本试验结果一致。试验中3种有机磷杀虫剂对瓜蚜乙酰胆碱酯酶活性抑制的强弱与生测结果一致。

因此呼和浩特地区在防治温室瓜蚜时,要注意瓜蚜对吡虫啉、氧乐果较敏感,但是也有产生抗药性的风险。在田间防治时,建议和其他药剂交替使用,同时也要控制用药次数。提倡合理使用杀虫剂,且要合理混用或交替、轮换用药,以保证防治效果,延长药剂使用寿命,使蚜虫的抗性水平保持在较低的敏感状态,延缓抗药性的发展。

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