针刺抑制幼鼠HIBD脑组织神经细胞凋亡的实验研究★

祁岩超 刘振寰 柴铁劬 唐纯志

1)广州医学院附属肿瘤医院(广州医学院肿瘤研究所) 广州 510095 2)广州中医药大学附属南海妇产儿童医院 南海 528200 3)广州中医药大学针灸推拿学院 广州 510405

细胞凋亡,又称程序性细胞死亡(programmed cell death,PCD)。研究已经证实,在脑组织缺血缺氧(hypoxicischemic brain damage,HIBD)时除缺血区神经元的坏死外还存在某些易损区内神经元选择性细胞凋亡,故在防治HIBD时,阻止细胞死亡,还是抑制细胞凋亡,均具有重要的治疗意义。各种围产期因素引起的HIBD,是导致儿童神经系统伤残,引起脑性瘫痪的常见原因之一。由于HIBD导致脑血流减少和脑组织生化代谢改变,引起脑组织一系列病理改变,如皮质梗死,丘脑、基底节和间脑等部位深部灰质坏死,脑干坏死,脑室周围或脑室内出血以及脑白质病变等。本实验模拟HIBD的病理改变,通过针刺的早期及超早期干预,观察针刺对新生幼鼠 HIBD脑神经细胞凋亡的抑制作用,探讨针刺对脑瘫的早期康复的可行性及作用机制。

1 材料和方法

1.1 动物选择 7 d龄新生SD幼鼠85只(由广州中医药大学实验动物中心提供,清洁级),雌雄各半,体质量11.5～18.4 g,平均(12.6±2.1)g,鼠饲养环境:清洁级动物实验室,温度22～26℃,相对湿度60%～80%,日光灯照射,定时通风换气,常规标准大鼠颗粒饲料喂养。造模前翻身、平衡、爬行功能测定均无异常。

1.2 模型制作和分组方法 模型制作参照文献[2]并加以改进;将成功的模型动物随机分为3组:A组:HIBD+针刺Ⅰ组,B组:HIBD+针刺Ⅱ组,C组:HIBD组;另设假手术组D组,每组24只。

1.3 针刺处理和针刺方法 取穴,定位参照《实验针灸学》[3],HIBD+针刺I组手术后24 h开始针刺,前7 d仅针四肢部穴位,第8天开始加针头部穴位。HIBD+针刺Ⅱ组手术后第8天开始针刺,头、体针同步。具体针刺方法同“针刺对幼鼠HIBD脑组织发育及NGF蛋白表达的实验研究”[4]。

1.4 观察指标 (1)海马锥体层CA1区锥体神经元个数:实验动物于缺血缺氧后21 d处死、取脑,观察脑的大体变化;双侧脑组织分别称质量;称取脑质量的脑组织,经中性甲醛固定后,按嘴侧至尾侧方向,从胼胝体膝至背侧海马作连续冠状切片,片厚50 μ m,对照Paxinos和 Watson图谱,确定上述切片背侧海马锥体层CA1区的中心部分,取3张连续脑片,以目镜网格测试系统在10×40倍下计数1 mm长度范围内的细胞数,取其平均值。(2)海马锥体层CA1区及左大脑额叶皮质神经细胞凋亡个数:细胞凋亡检测采用T UNEL法,按检测试剂盒购说明进行(武汉博士德生物制品公司)。

1.5 细胞凋亡记数方法 用图像分析仪在光镜下计算每张脑片中的神经细胞凋亡数目。凋亡神经细胞计数方法:细胞核呈棕黄色者为阳性细胞,即凋亡细胞。每张大鼠脑缺血部位切片随机取10个视野,计数凋亡细胞数,求其平均值。

1.6 统计学分析 应用SPSS 12.0统计软件包,计量资料以表示,率的比较采用 χ2检验,组间多均数比较采用方差分析(F-q检验)。

2 结果

2.1 脑大体检查及质量的改变 HIBD后21 d,D组脑大体观察未见明显改变,A、B、C组在左脑半球大部分呈程度不等的萎缩,各组左大脑质量比较差异有统计学意义,其中C＜B＜A＜D,4组动物右脑质量差异不明显。见表1。

2.2 海马锥体层CA1区锥体神经元计数 见表2。

2.3 海马锥体层CA1区及大脑额叶皮质神经元凋亡计数比较 见表3。

表1 脑质量的改变 (,mg)

表1 脑质量的改变 (,mg)

组 别 n 左大脑质量 右大脑质量HIBD+针刺I组 10 441.53±22.54 477.08±25.46 HIBD+针刺II组 10 411.53±20.91 471.12±24.54 HIBD组 10 345.75±21.02 470.5±30.86假手术组 10 473.16±13.54 474.2±29.37 F值 44.15 0.108 P值 ＜0.01 ＞0.05

表2 海马锥体层CA1区锥体神经元计数(,个/mm2)

表2 海马锥体层CA1区锥体神经元计数(,个/mm2)

组 别 n 左 右HIBD+针刺I组 10 106.37±10.46 140.34±20.51 HIBD+针刺II组 10 95.09±17.86 142.18±18.07 HIBD组 10 76.38±15.84 144.27±21.54假手术组 10 145.45±15.6 148.19±20.12 F值34.68 0.164 P值 ＜0.01 ＞0.05

如表2所示,4组右侧海马CA1区锥体神经元数差异无统计学意义(P＞0.05),左侧差异有统计学意义(P＜0.05),其中C＜B＜A＜D。

表3 海马锥体层CA1区及大脑额叶皮质神经元凋亡计数 (,个/高倍视野)

表3 海马锥体层CA1区及大脑额叶皮质神经元凋亡计数 (,个/高倍视野)

组 别 n 左 右HIBD+针刺I组 10 5.04±1.21 4.86±1.15 HIBD+针刺II组 10 6.50±1.01 5.09±1.06 HIBD组 10 23.41±4.37 12.15±3.72假手术组 10 3.18±1.35 3.26±1.13

如表3所示,4组左侧海马CA1区锥体神经元凋亡数差异有统计学意义,其中D＜A＜B＜C,左侧大脑额叶皮质神经元凋亡个数D＜A＜B＜C(P＜0.05)。

3 讨论

由于脑性瘫痪发病原因、病变机制以及临床症状都复杂多样,缺血缺氧是许多脑瘫脑损伤发生过程中所经历的重要病理环节,因此,本研究在借鉴国内外经验基础上,建立了新生乳鼠HIBD窒息脑瘫模型,开展针刺治疗HIBD的有关机制研究。

本研究参照Rice的方法利用结扎颈动脉和缺氧制成缺血缺氧性脑病的动物模型[2]的方法,复制了该模型,通过行为测试观察到其感觉和运动功能均存在一定障碍,至21 d时造模动物左脑大部分出现不同程度的萎缩,表明已成功建立了缺血缺氧性脑瘫模型。

目前研究细胞凋亡的方法较多,最常用的特异性检测凋亡细胞的方法为细胞原位标记法,亦为 TUNEL法,其基本原理是TdT可特异结合带3’-OH的核苷酸片段,并形成由dUTP-biotin组成的脱氧核昔酸多聚体,后经带有过氧化物酶的抗bi-otin抗体标记,经染色,阳性者提示细胞凋亡存在。

吴至凤等[5]采用结扎孕鼠双侧子宫动脉,完全阻断血供25min娩出胎鼠,制成脑损伤模型,将成功模型分为针刺组和模型组,每组8只,正常组剖宫取出胎鼠8只。正常组和模型组不予治疗,针刺组于出生后7～30 d行针刺治疗。30 d实验结束后断头取脑,用TUNEL法检测细胞凋亡,SABC法检测脑组织Bcl-2和Bax蛋白表达。结果表明,针刺可以减少脑损伤大鼠脑组织神经细胞的凋亡,提高Bcl-2蛋白的表达,降低Bax蛋白的表达。提示针刺具有抗局灶性脑缺血时脑细胞凋亡的效应。

本实验模拟HIBD病理改变,通过针刺百会、患侧颞Ⅰ针、内关、曲池、足三里、涌泉穴,观察针刺对 HIBD神经细胞凋亡的影响情况。结果在假手术组,大鼠脑内仅见少量TUNEL染色阳性细胞(图 1、2);在 HIBD幼鼠脑缺血缺氧后,大脑皮质及海马内可见大量的 TUNEL染色阳性细胞(图3、4);在HIBD+电针Ⅰ组及 HIBD+电针Ⅱ组,大脑皮质及海马内TUNEL染色阳性细胞显著减少(图5～8),与HIBD组相比,差异有统计学意义(P＜0.01)。且缺血+电针Ⅰ组神经细胞凋亡明显少于缺血+电针Ⅱ组,2组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。提示针刺可抑制HIBD后脑内神经细胞的凋亡,对HIBD具有一定的保护作用,且越早干预效果越好。这可能与针刺阻止HIBD后脂质过氧化连锁反应,从而抑制凋亡基因的启动和促进抗凋亡基因的产生,达到抗凋亡的目的。

[1]张苏明,方恩羽.缺血神经元分子生物学研究的现状与展望[J].中华神经科杂志,1997,30(4):251-253.

[2]Rice.The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat[J].Annals of Neurology,1981,9(2):131.

[3]李忠仁,主编.实验针灸学[M].北京:中国中医药出版社,2003:329.

[4]祁岩超,刘淑华,刘振寰,等.针刺对幼鼠 HIBD脑组织发育NGF蛋白表达的实验研究[J].中国实用神经疾病杂志,2008,11(12):1-4.

[5]吴至凤,温恩懿,赵聪敏,等.针刺对发育期脑损伤大鼠脑组织细胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表达的影响[J].重庆医学,2010,39(21):2898-2903.