化瘀泻浊方对肾间质纤维化实验大鼠TLR4、NF-кB 的影响

潘利敏，王凤丽，王彦凯，任秀喜，王月华△

(1.河北省中医院，河北 石家庄 050011;2.石家庄长城体检中心，河北 石家庄 050017)

肾间质纤维化(tubulointerstitial fibrosis TIF)是各种原因所致肾脏疾病进展至终末期肾功能衰竭的共同病理特征。减轻肾间质纤维化的程度能显著延缓慢性肾脏病向终末期肾病的进展速度[1]。Toll样受体4(toll-like receptor 4，TLR4)是 TLRs家族中的一员，Toll受体的研究首先是从果蝇开始的，其广泛分布于各种组织，在识别感染后通过外源性配体启动炎症反应，介导天然免疫和获得性免疫，亦在非感染性炎症疾病中有着重要的作用。TLR4介导胞内信号传递涉及不同通路，但最终都要激活核因子-кB(nuelear factork kappa B，NF-кB)。近年来关于 NF-кB的实验表明，它们是调节炎症反应的核心因子，既然 TLR4 可以激活 NF-кB[2、3]，我们推测其在 TIF中可能发挥了重要的作用。因此对TLR4、NF-кB的深入研究，必将有助于我们对肾间质纤维化发病机制的理解，为探索新的治疗途径和开发临床新药提供理论依据。

化瘀泄浊方是我们在临床上用于治疗慢性肾衰的常用方，有较好的临床疗效，在前期实验中我们已探讨了其部分作用机制[4、5]。本实验继以化瘀泄浊方对单侧输尿管结扎(unilateral ureteral obstruction UUO)诱导的肾间质纤维化大鼠模型进行干预性治疗，通过观察化瘀泄浊方对实验动物梗阻侧肾脏病理形态学、TLR4及NF-кB的影响，探讨化瘀泄浊方对肾间质纤维化的拮抗作用及部分作用机理，为临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 选用健康、雌性SD大鼠50只，体质量180g±10g，清洁级，由河北医科大学动物实验中心提供，动物合格证号冀医动管字第703058号。

1.1.2 主要试剂 兔抗大鼠 TLR4、NF-κB多克隆抗体由Santa Curz公司提供。免疫组织化学SP法检测试剂盒由北京中杉生物工程公司提供。

1.1.3 实验用药 化瘀泄浊方由生黄芪30g、生大黄 12g、地龙 12g、丹参 15g、蒲公英 15g、槐花 15g、生牡蛎30g、赤芍15 g等组成，由河北省中医院药房提供，上药按比例称取后，水煎、过滤、浓缩，装入瓶中密封备用。缬沙坦由诺华公司提供，批号X0538。

1.2 方法

1.2.1 动物模型和分组 动物随机分为假手术组、模型组、缬沙坦组、化瘀泄浊方组、阿魏酸哌嗪分散片组，每组10只。缬沙坦组给予缬沙坦5.3mg/(kg·d)经口灌服，化瘀泄浊方组给予化瘀泄浊方5.7g/(kg·d)经口灌服，阿魏酸哌嗪分散片组给予阿魏酸哌嗪分散片6.7mg/(kg·d)经口灌服，假手术组和模型组给予同等量生理盐水经口灌服。手术前1 d开始给药至实验结束前1 d。左侧输尿管结扎术参照文献进行。除假手术组外其余各组均行左侧输尿管结扎术。于实验第21天全部杀检，取左侧肾脏以4%多聚甲醛固定、包埋、切片，行HE及Masson染色进行病理学观察，并采用免疫组化方法检测TLR4、NF-кB的表达。

1.2.2 免疫组织化学方法 SABC法。半定量分析采用HPIAS-1000型全自动彩色病理图像分析系统，在200倍光镜下采集图像，每例各选15个视野，在光亮度和放大倍数一致的条件下对免疫组化结果进行自动测量，最后取平均值，TLR4的结果分析是相对阳性面积=阳性染色面积/视野大小×100%，NF-кB的结果分析是计算1个视野场中强阳性着色核占肾小管细胞核总数的百分比。

1.3 统计学处理方法

采用SPSS13.0统计软件包进行统计分析，采用One-Way ANOVA，组间两两显著性比较采用 LSD法，显著性标准为P<0.05。

2 结果

2.1 HE及Masson染色结果

肾组织HE及Masson染色显示，模型组肾间质有大量炎细胞浸润和纤维组织增生，肾小管部分萎缩、管腔闭塞或扩张，肾小球数目明显减少，面积缩小。肾小囊黏连或扩张，小囊周围大量纤维组织增生。其他各治疗组间质可见多少不等的炎细胞浸润，少量纤维组织增生，肾小管轻度扩张，部分肾小球轻度萎缩，小囊扩张，肾小球数量无明显改变。

2.2 各组大鼠肾间质纤维化面积半定量分析

表1 各组大鼠纤维化面积及TLR4、NF-кB蛋白表达半定量分析结果比较(s)

表1 各组大鼠纤维化面积及TLR4、NF-кB蛋白表达半定量分析结果比较(s)

注:与正常组比较:△P<0.01;与模型组比较:□P<0.01;与阿魏酸组比较:*P<0.05，○P<0.01

组别 n 纤维化面积(μm2)TLR4(%)NF-кB(%)假手术组82.476 63.536 88.376 10 872.41±116.62 0.25±0.09 2.93±0.98模 型 组 8 7830.78±1250.80△ 5.68±1.03△ 17.19±2.00△缬 沙 坦 组 9 4532.72±639.56△□○ 2.51±0.57△□○ 10.24±1.69△□*化 瘀 泄 浊 方 组 9 4660.27±991.14△□○ 2.29±0.88 9.79±1.35△□○阿魏酸哌嗪分散片组 9 5852.09±900.44△□ 3.64±0.86△□ 12.27±2.07△□F值

表1显示，模型组肾间质纤维化程度较重;缬沙坦组、化瘀泄浊方组、阿魏酸哌嗪分散片组与模型组比较，肾间质纤维化面积明显减少(P<0.05)，提示化瘀泄浊方、阿魏酸哌嗪分散片及缬沙坦均有拮抗肾间质纤维化的作用。其中，化瘀泄浊方组优于阿魏酸哌嗪分散片组(P<0.05)，其他各组间均无明显差异(P>0.05)。

2.3 TLR4蛋白的表达、分布及半定量分析

表1显示，TLR4主要表达于肾小管上皮细胞胞浆中，假手术组TLR4在肾小管上皮细胞中几乎无表达。与假手术组比较，其余各组在肾小管上皮细胞表达显著增强，间质细胞、肾小球内亦有微弱表达。半定量分析显示，模型组及各治疗组较假手术组TLR4的表达呈显著性升高(P<0.01);缬沙坦组、化瘀泄浊方组、阿魏酸哌嗪分散片组与模型组相比，TLR4的表达均呈显著性下降(P<0.05)。其中化瘀泄浊方组优于阿魏酸哌嗪分散片组(P<0.05)，其他各组间均无明显差异(P>0.05)。

2.4 NF-кB蛋白的表达、分布及半定量分析

表1显示，主要表达于肾小管上皮细胞核中。半定量分析显示，模型组及各治疗组较假手术组NF-кB的表达呈显著性升高(P<0.01);缬沙坦组、化瘀泄浊方组、阿魏酸哌嗪分散片组与模型组相比，NF-кB的表达均呈显著性下降(P<0.05)，其中，化瘀泄浊方组优于阿魏酸哌嗪分散片组(P<0.05)，其他各组间均无明显差异(P>0.05)。

3 讨论

3.1 化瘀泄浊方的用药依据

各种慢性肾脏疾病迁延不愈，最终均导致慢性肾衰竭，肾间质纤维化是慢性肾衰竭的主要病理特征，本研究采用单侧输尿管结扎方法为研究肾间质纤维化的典型模型。本病属于中医的“淋证”、“腰痛”、“癃闭”、“关格”等范畴，其病因病机有以下几个方面。一是先天异常。肾为先天之本，禀赋于父母之精气，若先天不足，肾精亏虚则尿管及肾发育异常;二是湿热蕴结。外邪入侵，郁而化热，蕴结于肾与膀胱;或内热下移，湿热互结，膀胱气化不利，水液内停;三是瘀血络阻。久病多瘀、血不利则病水，瘀血阻滞，尿路不畅，水湿郁结于内;或瘀血内阻，气滞血瘀，阻塞尿路。总之，本病是以湿热、瘀血、络阻等为基本病机，且相互转化、相互影响。本实验以化瘀泄浊中药对单侧输尿管结扎诱导的肾间质纤维化大鼠模型进行干预性治疗，符合上述病机具有可行性。方中丹参、赤芍、大黄、地龙活血通络，化瘀泄浊;蒲公英、槐花清热利湿，解毒泄浊;加用生牡蛎软坚散结;生黄芪益气，且黄芪益气有走而不守之性，所以本品益气不仅可以扶正固本，又可以助丹参、地龙等行血消瘀通络祛邪治标。诸药相伍通补并用、标本兼顾，故成为我们临床用于延缓肾脏病发展进程的基础方。

3.2 化瘀泄浊方的作用机理探讨

肾小管间质纤维化(renal tubulointerstitial fiborsis)是多种慢性肾脏疾病如慢性肾炎、慢性肾盂肾炎、狼疮性肾炎、糖尿病肾病等发展到终末期肾衰的共同途径。它以过量细胞外基质在肾间质积聚及肾间质成纤维细胞增生为特征。TLR4是介导内毒素脂多糖(LPS)反应的细胞表面特异性受体。LPS与其受体 TLR4结合，最终都要激活 NF-кB或MAPK。NF-кB是诱导前炎症因子表达的中枢调节器，在肾脏的肾小球细胞、肾小球上皮细胞和肾小管上皮细胞中广泛存在，TLR的信号级联放大作用使IкB磷酸化降解，NF-кB得以激活并移位进入细胞核，与DNA分子上炎症反应调节基因中启动子区域的NF-кB结合位点相结合，启动细胞因子(如 IL-l、IL-6、IL-8、IL-12、INF-a、MIP、VCAM-1、ELAM-1 以及组织因子、黏附分子及诱导型一氧化氮合成酶等)基因的转录、翻译，最终导致炎症因子大量释放。一些被NF-кB激活的因子又会反过来进一步诱导NF-кB的激活，在生物体内产生级联放大的炎症反应。大量体外及动物实验已证实，在多种肾脏疾病中，存在NF-κB的表达和活化，抑制 NF-κB活性可改善肾脏炎症和肾间质纤维化。我们的研究发现，TLR4、NF-κB在梗阻性肾病导致肾间质纤维化中的表达是升高的，说明TLR4在肾间质纤维化疾病中可以通过激活NF-κB参与肾间质纤维化的发展，进而我们认为化瘀泄浊方能通过抑制肾组织TLR4、NF-кB蛋白的表达，从而减轻肾脏病理损害，减少纤维化面积，延缓病变肾组织纤维化进程。

[1]王海燕.重视和研究小管-间质损害肾小球疾病发展和预后中的作用[J].中华肾脏病杂志，2000，16(1):5-6.

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[4]潘利敏，王彦凯，王月华，等.化瘀泄浊方对肾间质纤维化实验大鼠增殖细胞核抗原的影响[J].中国中医基础医学杂志，2009，15(11):832-833.

[5]潘利敏，王彦凯，王月华，等.化瘀泄浊方对肾间质纤维化实验大鼠肾小管上皮细胞转分化的影响[J].中国中医基础医学杂志，2009，15(9):668-669，672.