大鼠急性脑出血后对重要脏器的影1)响及外周血核因子-κ B表达的研究

邵玉凤,韩漫夫,任 凯,杨欣建

急性脑出血患者并发多脏器功能障碍综合征在临床上较常见,可影响患者的预后,是急性脑血管病致死的主要原因之一。目前在外科与创伤领域,动物及临床研究均证实全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)是发展为全身多脏器功能损害(multiple organ dysfunction syn drome,MODS)的必由之 路[1]。核因子-κ B(nuclear factor kappa B,NF-κ B)在全身炎症反应中起着关键的作用[2]。本实验观察大鼠脑出血后肝、肾、肺等脏器功能和病理学改变,及外周血核因子-κ B的表达,了解急性脑出血后对上述重要脏器的影响及其与核因子-κ B表达的关系。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 健康雄性SD大鼠20只,体重250 g～300 g,由中山医科大学实验动物中心提供。将大鼠随机分为脑出血组、假手术组,每组10只。

1.2 方法

1.2.1 大鼠脑出血模型制作[3]根据大鼠立体定向图谱确定拟注入的左侧尾状核位置,将大鼠用10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉后,凝固血组大鼠完成立体定向术后从术后从立体定向仪上取下,仰卧位固定,右侧腹股沟备皮,纵行切口,暴露并分离右侧股动脉,结扎远心端,用1 mL注射器接4.5号头皮外穿刺股动脉抽取100 μ L自体动脉血,立即注入更换了针头的50 μ L微量注射器内,结扎股动脉近心端,缝合皮肤。血液静置5 min使之充分凝固。微量注射器接套管针将凝固血快速注入靶点内(注射速度20 μ L/min)。留针30 min后拔除套管针。假手术组大鼠完成立体定向术及股动脉抽血,但不注血。

1.2.2 核因子-κ B活性测定 外周血淋巴细胞分离、涂片,抗NF-κ B-p65单克隆抗体购自 Thermo Scientific公司,工作浓度1∶100。假手术组淋巴细胞涂片作为阳性对照。采用 Envision两步法进行 。结果判定,细胞核上呈现棕黄色为阳性,未见着色细胞者为阴性。每一玻片任选5个高倍视野(×400),计算阳性细胞百分率(阳性细胞数/计数细胞总数×100%)。

1.2.3 血清酶及血氧饱和度含量等测定 各组麻醉后24 h,经腹主动脉取血,离心取上清,使用日立公司的全自动生化分析仪,及血气分析仪常规测定血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)水平及血氧饱和度(SaO2)的水平。

1.2.4 病理形态学观察 取肝肺组织,经10%中性甲醛固定24 h后,常规石蜡包埋、切片,HE染色。光学显微镜下观察肝脏及肺脏结构形态的改变。

2 结 果

2.1 大鼠脑出血模型观察 凝固血组所有10只大鼠清醒后观察其行为改变,均出现右侧肢体偏瘫,旋转爬行或拖步行走等,取脑时尾状核内均可见血肿形成。原发血肿局限在尾状核内,形态较规则,呈椭圆形,占位效应明显,表明脑出血模型制作成功。假手术组大鼠未出现上述神经缺损症状,脑内亦无血肿形成,可排除脑出血。

2.2 大鼠 ALT、AST、SaO2、BUN、Cr和 NF-κ B 表达的 大鼠脑出血后24 h血清中ALT、AST的含量均明显增高,血氧饱和度下降,与假手术组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。大鼠急性脑出血后其肝功能及肺功能受损。大鼠脑出血后24 h血清 BUN、Cr的含量均明显增高,外周血淋巴细胞NF-κ B活性升高,与假手术组比较差异有统计学意义(P＜0.05),大鼠急性脑出血后其肾功能亦受损伤,且核因子-κ B表达升高。详见表1、表2。

表1 大鼠脑出血后24 h血清A L T、AST等含量(±s)

表1 大鼠脑出血后24 h血清A L T、AST等含量(±s)

组别 n AL T(U/L)AST(U/L)SaO2(%)假手术组 10 47.37±8.02 108.00±22.19 97±23脑出血组 10 113.56±37.12 214.00±78.35 94±18 P＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

表 2 大鼠脑出血后血清 BUN、Cr、NF-κ B含量(±s)

表 2 大鼠脑出血后血清 BUN、Cr、NF-κ B含量(±s)

组别 n BUN mmol/L Cr μ mol/L NF-κ B%假手术组 10 10.01±0.86 17.03±9.01 30.30±4.87脑出血组 10 13.93±5.09 29.06±10.04 42.68±4.05 P＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

2.3 光镜观察结果 假手术组大鼠肝脏结构形态正常,脑出血组肝细胞索排列紊乱,灶性肝细胞变性,肝细胞肿胀、排列紊乱,肝窦扩张、淤血,大量炎性细胞浸润;假手术组肺组织无病理改变;脑出血组肺间隔增厚,间质明显水肿,大量中性粒细胞浸润,中度肺出血,组织损伤严重。

3 讨 论

脑出血常伴有多器官功能损害,究其病因,目前大部分认为是由于急性脑出血后出现全身炎症反应综合征(SIRS),失控的全身炎症反应综合征造成多种细胞因子及炎性介质的失控性释放,继而出现全身多脏器功能损害[1]。本研究发现,急性脑出血大鼠24 h后血清ALT、AST含量明显增高,血氧饱和度下降,血清BUN、Cr含量明显增高,说明其肝功能、肺功能及肾功能均有受损,病理切片镜检均发现有不同程度的炎症反应改变,更直接证实了急性脑出血在动物试验中可造成肝、肾、肺的损害。

细胞核因子-κ B是细胞中一个重要的转录因子,是多种炎症介质的上游信号分子,其激活后可促进多种炎症介质的产生,处于调节炎症反应的中心环节。脓毒症中NF-κ B的活性增加与不良预后有关[4]。选择性阻断NF-κ B途径可影响系统性的全身炎症反应及多脏器功能障碍发生[5]。本研究发现,在大鼠脑出血后24 h其外周血淋巴细胞核因子-κ B活性升高,与假手术组比较有统计学意义(P＜0.05),且同时伴有大鼠肝、肾、肺功能受损,细胞核因子-κ B活性升高与大鼠脑出血后多脏器功能损害有关。

[1]Neuhold S,Huelsmann M,Strunk G,et al.Comparison ofcopeptin,B-type natriuretic peptide,and amino-terminal pro-B-type natriuretic peptide in patients with chronic heart failure:Prediction of death at different stages of the disease[J].J Am Coll Cardiol,2008,52(4):266-272.

[2]Sharif-Askari E,Vassen L,Kosan C.Zinc finger protein Gfi1 controls the endotoxin-mediated Toll-like receptor inflammatory response by antagonizing NF-kappaB p65[J].Mol Cell Biol,2010,30(16):3929-3942.

[3]吕田明,陆兵勋.大鼠尾状核注射凝固自体动脉血脑出血模型[J].中风与神经疾病杂志,2006,23(1):988-941.

[4]Hubert B,Feng Q,T homas Z,et al.Role of NF-κ B in mortality of sepsis[J].Clin Invest,1997,100:972-985.

[5]Xu H,Ye X,Steinberg H.Selective blockade of endothelial NF-kappaB pathway differentially affects systemic inflammation and multiple organ dy sfunction and injury in septic mice[J].Pathol,2010,22(4):490-498.