FQ-PCR检测人肠道乳酸杆菌的研究

冯玉奎，郑长青，孙英姿，高 波

乳酸杆菌（Lactobacillus）是在乳酸菌中与动物关系最密切的菌属，动物和人类从口腔到直肠始终有该菌存在，是动物肠道中占优势的菌群之一。当动物消化道中乳酸杆菌的比率下降，则动物消化机能紊乱，严重者导致动物肠炎、下痢等疾病。乳酸杆菌的数量变化往往预示着人身体状态发生变化。因此确切了解乳酸杆菌变化及对乳酸杆菌进行精确定量对疾病的诊断有着重要的意义[1-4]。

本研究依据乳酸杆菌16S rDNA序列设计属特异性引物，以常规PCR产物经克隆后的质粒DNA为标准品，经光谱定量、梯度稀释后制备标准曲线。抽提肠道菌群的细菌基因组DNA，用实时荧光定量PCR技术定量分析样品中乳酸杆菌数量。

该项目完成后，有望建立一种高灵敏度的乳酸杆菌及肠道菌群定量检测体系，该检测体系将为定量检测乳酸杆菌提供有效的实验手段，并为相关检测试剂的研制奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 检测样品 40份成年健康人粪便。用无菌离心管收集其粪便标本，置在-20℃冰箱保存备检。

1.1.2 工具酶和试剂 Genomic DNA purification kit、Gel and PCR clean-up system、质粒小量纯化试剂盒购自购自Promega公司；RealMasterMix(SYBR Green)为北京天根公司产品；pMD18simple-T vector、ExTaq DNA 聚合酶、DNA Marker DL2000等购自日本TAKARA生物工程公司；MRS培养基购自北京陆桥技术有限责任公司。

1.1.3 仪器 本研究中所用的定量PCR仪为美国应用生物系统公司ABI Prism 7000型荧光定量PCR仪。

1.2 乳酸杆菌的传统活菌计数 乳酸杆菌的活菌计数依标准方法精确取0.1 g粪便利用MRS培养基培养计数，其详细步骤见文献[5]。

1.3 FQ-PCR引物的设计 利用DNAMAN引物设计软件设计扩增乳酸杆菌的引物。所选用的上下游引物如下， 引物 1：5'CTGATG AAAGCCCTCG3'；引物 2：5-GAGCCTCAGCGTCAGTG 3'； 扩增片段为230bp。引物序列经过BLAST检索（www.ncbi.nlm.nih.gov/blast），具有很强的特异性。引物由北京三博远志有限公司合成。

1.4 病原菌DNA的提取 粪便标本于常温下融冻，取0.1 g大便，加10 ml磷酸盐缓冲液，充分混匀5 min；1000 r/min离心 10 min，取上清液，利用Promega公司的细菌基因组DNA提取试剂盒进行，过程参照其说明书。所有乳酸杆菌基因组DNA，于-20℃保存。

1.5 常规PCR反应 取乳酸杆菌基因组DNA抽提液进行常规PCR反应。反应体系为50 μl，10×PCR buffer 5 μl，10 mmol/L dNTP 混合物 4 μl，上、下游引物各10pmol，Ex Taq DNA聚合酶2.5U，加去离子水至50 μl。PCR扩增程序为：94℃变性5 min；94℃ 30 s→56℃ 30 s→72℃ 30 s，循环 42次；72℃延伸5 min。在扩增结束后取PCR产物10 μl与DNA Marker DL 2000同时进行2%琼脂糖凝胶电泳。

1.6 标准品质粒的构建 将PCR扩增产物进行纯化回收并与pMD18simple-T载体连接，转化大肠杆菌E.coli Top10，经蓝白斑筛选，随机挑取4个白色克隆，菌落PCR鉴定得到阳性克隆后，小量制备质粒DNA，再进行PCR鉴定并送北京华大中生公司测序。用紫外分光光度计准确定量后，根据以下公式计算出其拷贝数，进行10倍梯度稀释，作为标准品保存于-20℃备用。

1.7 实时定量PCR检测乳酸杆菌的数量

1.7.1 标准曲线的建立 以10倍梯度稀释的质粒标准品为模板，进行实时荧光定量PCR。PCR反应在 20 μl体系中进行， 包括 RealMasterMix（SYBR Green）9 μl，模板 1 μl，上、下游引物各 10 pmol，加无菌去离子水至20 μl。PCR扩增程序为：94℃变性5 min；94℃ 30 s→56℃ 30 s→72℃ 30 s， 循环42次；read plates，72℃延伸5 min。用起始模板拷贝数的lg值对每个稀释标准品的CT值绘图，得到标准曲线。

1.7.2 乳酸杆菌数量的测定 实时定量PCR反应体系及反应条件同上，对40份乳酸杆菌基因组DNA样品进行检测，同时设阴性对照（不加模板）及阳性对照。根据测得的CT值与标准曲线得到样品中DNA拷贝数。

1.8 统计学处理 用SPSS 13.0统计软件进行统计学处理，所得结果经对数转换后以 x（lgx）±s（lgx）表示，采用单因素方差分析方法分析荧光定量PCR和传统培养对于乳酸杆菌定量的差别。

2 结 果

2.1 标准品质粒的构建与鉴定 标准品质粒的PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳，扩增片段大小符合预期约230bp，结果见图1。

图1 乳酸杆菌标准品质粒PCR检测结果

2.2 标准曲线的建立 标准品质粒拷贝数以104～108copies/μl的梯度稀释的标准品质粒为模板，进行实时荧光定量PCR。标准品扩增曲线如图2，标准品熔点曲线如图3，建立标准曲线如图4。标准曲线的直线回归相关系数r=－0.996 6。

图2 乳酸杆菌标准品扩增曲线

图3 乳酸杆菌标准品熔点曲线

图4 标准曲线图

2.3 检测样品中DNA数量的测定 各粪便样品基因组DNA用定量PCR进行检测，根据CT值与标准曲线计算得到每克标本中乳酸杆菌的数量。与培养法相比，荧光定量PCR检测所得结果与培养方法获得的结果接近（P>0.05）。见表1。

表1 两种方法所得结果（±s拷贝数/g湿便）

表1 两种方法所得结果（±s拷贝数/g湿便）

细菌 定量PCR法 培养法 T值 P值乳酸杆菌 9.3±1.5 8.9±1.3 1.215 0.087

3 讨 论

FQ-PCR技术创立于1996年，由美国Applied Biosystems公司推出，是一种在PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。FQ-PCR技术是通过在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。FQ-PCR技术融合PCR技术和DNA探针杂交技术的优点，直接探测PCR过程中荧光信号的变化使PCR的扩增及其分析过程均在同一封闭系统下完成，并在电脑分析软件支持下实现对PCR扩增产物的动态监测和自动定量，现在已广泛应用于生物学、基础医学、疾病诊断、食品、水质环保、药物开发等领域，被认为是核酸定量的金标准[6，7]。

肠道菌群的微生态平衡与人的健康及疾病有着密切的关系[8-10]。正常人肠道中的菌群，主要为厌氧菌，少数为需氧菌，前者约为后者的100倍。存在于肠道的正常菌群为类杆菌、乳杆菌、大肠杆菌和肠球菌等，尚有少数过路菌，如金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、副大肠杆菌、产气杆菌、变形杆菌、产气荚膜杆菌、白色念珠菌等。在正常情况下，这些微生物互相依存，互相制约，维持平衡，保持一定的数量和比例[11-13]。在人体抵抗力降低的情况下，如瘦弱婴幼儿，年老体弱和患急、慢性疾病者，以及长期、大量使用广谱抗生素、免疫抑制剂、肾上腺皮质激素、抗肿瘤药物和放射治疗者，尤其是应用广谱抗生素者，可使肠道正常菌群被抑制而数量减少，耐药的过路菌过量繁殖，造成肠道菌群失调。出现临床症状者，称为肠道菌群失调症[14-17]。因此确切了解肠道菌群变化及对肠道菌群进行精确定量对疾病的诊断有着重要的意义。

传统的乳酸杆菌检测方法是基于细菌的形态学、生理学和生物化学特征，在特殊培养基上经厌氧培养、菌落计数来实现的，其过程易受细菌离体时间、外界环境因素、培养基性能和非特异性菌落混杂等多种因素影响，检测失败率高，结果缺乏稳定性和可靠性，且费时费力，计数不精确，属半定量检测。

本研究应用荧光定量PCR的方法对健康人群的肠道菌群中的乳酸杆菌进行了定量分析，并和传统方法进行了比较。其结果和其它文献报道的用培养的方法得到的结果接近，也说明了荧光定量PCR法可以准确特异地对肠道菌群进行定量。此技术为进一步研究实验动物和人肠道菌群的组成及其动态变化提供了有效的检测手段，具有较好的实验研究和临床应用的前景。

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