TG2与卷烟烟气致支气管上皮细胞恶性转化的相关性研究

姚虎胜，易 克，杨陟华，朱茂祥

（1.湖南农业大学生物科学技术学院，湖南 长沙 410128；2.湖南中烟工业有限责任公司原料采购中心，湖南 长沙 410014；3.军事医学科学院放射与辐射医学研究所，北京 100850）

肺癌是人类最常见的恶性肿瘤,已成为目前癌症死亡的首要病例。流行病学调查表明，多种人类广泛接触的因素与肺癌的发生有关[1]，目前公认吸烟是引起肺癌的首要因素[2]。现代生物学试验与流行病学研究表明，肿瘤发生与细胞基因突变有关，其发展呈阶段过程，即启动、促癌和发展等3个过程。因此，从基因水平上研究支气管上皮细胞对卷烟烟气的反应及细胞的恶性转化过程是肿瘤研究的关键所在。研究表明，TG2参与多种生理过程且与多种疾病尤其是肿瘤的发生发展有关[3-5]，目前对TG2的研究主要集中在肿瘤发生后，研究对肿瘤的转移与浸润、治疗及预后的影响，所用材料大多都是肿瘤细胞[6-8]。本试验所用材料为恶性转化的支气管上皮细胞，研究的时期为肿瘤发生的早期事件（即细胞的恶性转化阶段），以期为吸烟致肺癌的早期诊断提供一些依据，同时也提供一个肿瘤早期治疗的分子标靶。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

LHC-8完全培养液（美国Gibical公司）；Kentukey Reference 2R4F卷烟（University of Kentucky）；TG2一级抗体（Abcam公司）；TG2活性检测试剂盒（Sigma公司）；增殖检测试剂盒（Invitrogen公司）；凋亡检测试剂盒（invitrogen公司）；CO2细胞培养箱（Thermo公司）；酶标仪（BIO-RAD 860）；流式细胞仪（FACSCalibur，BD Bioscience公司）

1.2 试验方法

1.2.1 卷烟烟气总粒相物（TPM）的制备 TPM收集方法参考按国家标准GB/T 5606.1-2004、GB/T19609-2004、GB/T 16447-2004。所需受试样品抽吸完后，空吸3口，剑桥滤片（直径44 mm）收集TPM，用DMSO溶解备用，调整浓度为10 mg/mL。

1.2.2 细胞培养 人乳头瘤病毒（HPV-18）永生化的人支气管上皮细胞（BEP2D细胞）由军事医学科学院提供，用LHC-8无血清培养液、37.5℃、5%CO2条件下培养。

1.2.3 细胞存活率检测 以MTT法检测BEP2D细胞存活率[8]。细胞存活率计算方法见式（1）。

1.2.4 Western-blot分析 收获BEP2D细胞，提取蛋白质，各上样30 μg，聚丙烯酰胺凝胶电泳后转膜，用第二抗体偶联物进行免疫检测，发光底物显迹法显迹。在暗室中用感光胶片进行放射自显影，经显影、定影后分析杂交信号。分析的信号为整合的光密度值（OD）。试验重复3次，统计学检验用单侧t检验，以P<0.05为有统计学显著性。

1.2.5 TG2活性检测、细胞凋亡试验、细胞增殖试验、细胞周期试验 以上试验均按所购试剂盒说明书操作。

2 结果与分析

2.1 细胞存活试验

细胞存活率如图1所示。由图1A可以看出，TPM与细胞存活剂量效应关系明显，根据量效曲线计算 2R4F的 IC50为 132 μg/mL。图 1B 为 60 μg/mL TPM浓度下，不同染毒时间对细胞存活率的影响，可以看出小于24 h时存活率>80%,因此选取10、30、60 μg/mL（存活率>80%）作为染毒剂量。

图1 TPM处理对BEP2D细胞相对存活率的影响

2.2 Western-Blot试验

由图2可以看出，随着TPM浓度升高，BEP2D细胞中TG2蛋白的表达量呈下降趋势，说明单次染毒就能使BEP2D细胞中TG2蛋白表达下调。由图3可以看出，P40(染毒40代的BEP2D细胞)的TG2蛋白表达明显减少，而P40细胞RA（TG2激活剂）处理后TG2蛋白表达水平基本恢复到正常细胞水平。

图2 不同剂量TPM处理24 h后BEP2D细胞中TG2蛋白表达情况

图3 不同类型BEP2D细胞中TG2蛋白表达情况

2.3 TG2活性检测试验

由图4可以看出，TPM 60 μg/mL时，随着染毒时间延长，TG2蛋白活性呈下降趋势，12 h达到最低值，24、36 h时较12 h有一定回升，但均低于空白对照的50%；而染毒24 h，随着染毒剂量增大，TG2活性呈明显下降趋势，这与Western-Blot的结果一致。由图5A可以看出，P40细胞中TG2活性比正常细胞的低，而RA处理后细胞中TG2活性基本恢复到正常细胞水平，与Western-Blot的结果一致。由图5 B可以看出，TPM及MDC[Monodansylcadaverine，丹(磺)酰戊二胺]均能使细胞中TG2活性下降，而同时处理则不能使TG2活性进一步下降。

图4 BEP2D细胞TPM60 μg/mL不同染毒时间、24 h不同染毒剂量对TG2蛋白活性的影响

图5 不同细胞及处理TG2蛋白活性变化情况

2.4 细胞凋亡试验

通过Annexin V/PI染色方法，可以检测早期细胞凋亡。从早期凋亡的统计结果，可以明显看出（图6），P40和正常细胞的自发凋亡相差无几，而加TPM刺激时，两者细胞的凋亡率均上升，其中正常细胞+TPM的凋亡率比P40+TPM上升得更多，这可能与P40细胞已经恶性转化有关。而P40加RA刺激后（TG2活性增强），凋亡明显增强 ，说明TG2在细胞恶性转化后对细胞的凋亡有很大影响（促进凋亡）。正常细胞加MDC处理后（TG2活性下降）无明显变化，可能和TPM+MDC处理与TPM单独处理对TG2活性影响差不多，也可能与正常细胞中TG2活性对细胞凋亡的调控作用有限有关。

图6 早期凋亡结果

2.5 细胞增殖试验

CFSE染色可以检测不同细胞及处理的增殖情况。CFSE染色后，每分裂一次，荧光强度减半，通过荧光强度的几何平均值就可判断细胞增殖的情况，增殖越快，荧光强度的几何平均值越低。由表1可以看出，P40细胞和正常细胞相比，荧光强度的几何平均值变小，说明恶性化的P40增殖速度较正常细胞明显加快，而P40细胞加RA处理后，荧光强度向正常细胞回复，荧光强度的几何平均值几乎回复到正常细胞水平。而正常细胞加MDC处理（TG2表达下调）同样能使细胞使荧光强度减少，增殖加快。这说明TG2的活性在正常细胞及恶性转化细胞中都对细胞增殖起重要的调控作用。

表1 处理24 h后CFSE荧光强度（几何平均值）

2.6 细胞周期试验

采用流式细胞仪分析正常组、P40组、正常组加MDC处理组、P40加RA处理组细胞周期各时相的比例见表2。P40组和正常组比较，G0G1期所占比例明显减少，P40加RA处理后向正常组回复，而正常组加MDC处理后变化无统计学意义。这说明TG2活性对恶性转化BEP2D细胞周期调控作用明显，而对正常细胞的周期调控不明显。

表2 处理24 h后周期分布 （%）

3 讨论与结论

恶性转化的BEP2D细胞中TG2表达下调，并且CSC单次刺激BEP2D细胞也可导致TG2表达下调。通过TG2的激活剂和抑制剂调控TG2的活性，发现恶性转化P40细胞中TG2下调，周期、增殖、凋亡异常，可见改变TG2活性能够改变P40细胞的周期、增殖、凋亡。这说明TG2可能通过上述几个生理过程影响细胞的恶性程度。正常细胞中TG2表达及活性改变对细胞的周期、增殖、凋亡影响不明显，可能在恶性化过程中影响因素很多，TG2只是其中一个因素，不足以决定细胞恶性转化。

[1] Geneva.Reducing Risks,Promoting Healthy Life[A].World Health Organization,The World Health Report[C].2002.

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