南极磷虾酶解工艺的研究

吕传萍，李学英，杨宪时，迟 海，郭全友

（1.中国水产科学研究院东海水产研究所，上海 200090；2.上海海洋大学食品学院，上海 201306）

南极磷虾资源丰富，据估计最高有数亿吨之巨[1]，具有极大的开发和利用潜力[2]。南极磷虾营养丰富，蛋白质、脂肪等营养物质含量高，其肌肉鲜样中含粗蛋白16.31%，粗脂肪1.30%[3]。Chen等[4]指出南极磷虾蛋白所含的必须氨基酸含量可满足FAO/WHO/UNU1985推荐的成年人对蛋白的摄入要求。南极磷虾中含有丰富的矿物质元素，包括钙、磷、铁、锌、硒等[5]，其中，镁、钙、磷3种元素均满足美国农业部推荐的人类各个年龄阶段每日膳食营养，还含有多种活性物质，如蛋白消化酶、类胞菌素氨基酸等。这些酶与磷虾体内的酶抑制系统结合使得南极磷虾的消化系统非常强大，但是一旦其酶抑制系统遭到破坏，南极磷虾即会自溶[6-8]。试验以水解度为指标，探讨添加中性蛋白酶酶解南极磷虾的效果，通过试验筛选南极磷虾最优酶解工艺条件，以期为南极磷虾高值化加工利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

南极磷虾由我国南极海洋生物资源开发利用项目组于2010年1月南极FAO 48.1区捕捞，2010年4月冷冻条件运抵实验室，在-28℃条件下贮藏备用；枯草杆菌中性蛋白酶，实测酶活力145 733 U/g，（诺维信（中国）生物技术有限公司）；木瓜蛋白酶，实测酶活力57 866 U/g，（上海江莱生物科技有限公司）；硫酸铜、甲醛、氢氧化钠、盐酸等，均为国产分析纯，（国药集团化学试剂有限公司）。

1.2 仪器与设备

CF 16XII高速冷冻离心机（日本Hitachi公司）；电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）；85-2恒温磁力搅拌器（上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司）；FA1004A电子天平（上海精天电子仪器有限公司）；testo 230 pH值/温度测量仪（德图仪器上海有限公司）；DS-1组织捣碎机（上海精科实业有限公司）；KDN-04定氮消化炉（上海嘉定粮油仪器有限公司）。

1.3 测定方法

改进的Folin-酚法测定酶活力[9]，总氮含量采用GB/T5009.5-2003凯氏定氮法，甲醛电位滴定法[10]测定氨基酸态氮（AAN）含量，水解度按如下公式[11-14]计算：

1.4 南极磷虾自溶水解度分析

（1）自溶条件为固液比1:1（即取南极磷虾匀浆15 g，加水15 mL），水解温度50℃，水解时间分别设置在 0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4 h，测定不同温度下的自溶水解度（自溶条件下的水解度），以确定50℃时的最佳水解时间。

（2）自溶条件同上，水解温度设置为 3、20、30、40、50、60、70℃，水解时间为 4 h，测定不同温度下的水解度，以确定在最佳水解时间时的最高水解温度，从而确定南极磷虾的最大自溶量。

1.5 蛋白酶酶解南极磷虾的单因素试验

选择木瓜蛋白酶和枯草杆菌中性蛋白酶对南极磷虾进行酶解，酶解条件同上，分别以酶解时间（1、2、3、4、5、6 h）、 酶 解 温 度（3、30、40、50、60、70℃）、酶添加量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%）、pH 值（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5）为单因素，选择各因素影响酶解的最适条件。

1.6 蛋白酶酶解南极磷虾工艺流程及工艺条件优化

南极磷虾酶解工艺流程：冻南极磷虾15 g→加水匀浆（按质量比1∶1）→调节pH值→指定时间内保温酶解→灭酶（沸水浴10min）→冷却→离心（11 000 r/min，5min，4℃）→南极磷虾水解液。

酶解条件同上，选择L9（3）4正交设计方案，以水解度为指标，着重研究酶解时间、温度、pH值以及酶添加量4个因素对南极磷虾蛋白水解效果的影响，并确定木瓜蛋白酶和枯草杆菌中性蛋白酶的水解工艺条件。

2 结果与分析

2.1 南极磷虾最大自溶量的确定

图1所示，南极磷虾的自溶水解度随着时间的延长而不断升高，从第3 h开始水解度为（27.87±0.59）% ，3.5 h 时 为 （28.28 ±0.08）% ，4 h 时 为28.63%，自溶水解度增速放缓，这说明随着时间的延长，南极磷虾的自溶水解度上升空间较小，因此，本实验设计中选择南极磷虾的自溶时间为4 h。

图1 南极磷虾在不同时间下的自溶水解度

图2可得，在冷藏温度3℃条件下，南极磷虾仍有较强的自溶能力，自溶水解度为（16.59±0.30）%。2～50℃时，随着温度的升高，南极磷虾自溶水解度不断升高，50℃时达到最高值（28.11±0.16）%，50～70℃时，自溶水解度呈下降趋势，且60～70℃时下降较快。这说明，南极磷虾体内的自溶酶在50℃时活性最高，小于50℃时，自溶酶活性随温度的升高而不断升高；大于50℃时，自溶酶活性随温度的升高而降低，且下降速度较快。但即使是在70℃的高温下，南极磷虾的自溶水解度仍有（15.84±0.95）%，这说明南极磷虾体内自溶酶能适应较大的温度范围，这与任艳等[15]的观点一致。

图2 南极磷虾在不同温度下的自溶水解度

综合图1和图2可知，南极磷虾在50℃、自溶时间为4 h时，自溶水解度可达到28.63%。

2.2 中性蛋白酶酶解南极磷虾的单因素试验结果

2.2.1 时间对蛋白酶酶解南极磷虾水解度的影响图3所示，随着时间的延长，蛋白酶酶解南极磷虾的水解度不断升高，1～4 h内水解度升高显著，4～6 h水解度变化不大，这说明水解4 h时，蛋白酶基本将南极磷虾水解完全，为了准确确定蛋白酶酶解南极磷虾的时间，于是设置4、5、6 h为正交试验的3个时间因素。

图3 蛋白酶酶解南极磷虾的水解度随时间的变化

2.2.2 温度对蛋白酶酶解南极磷虾水解度的影响图4所示，3～50℃时，随着温度的升高，蛋白酶酶解南极磷虾的水解度不断升高，50℃时达到最高，这是由于酶促反应与一般化学反应一样，温度升高速度加快；50～70℃时，水解度不断下降，由于酶是一种蛋白质，随温度升高，酶蛋白逐渐变性失活，引起酶反应速率下降。由图中可知，在不同的酶解温度下，枯草杆菌中性蛋白酶酶解南极磷虾的水解度一直低于木瓜蛋白酶的水解度，为了更加准确的确定蛋白酶酶解南极磷虾的温度，选取45、50、55℃为正交试验的3个温度指标。

图4 蛋白酶酶解南极磷虾的水解度随温度的变化

2.2.3 pH值对蛋白酶酶解南极磷虾水解度的影响

图5所示，当pH值在6.0～7.5范围内变化时，木瓜蛋白酶和枯草杆菌中性蛋白酶酶解南极磷虾的水解度均在不断升高，且木瓜蛋白酶的酶解效率一直高于枯草杆菌中性蛋白酶；当pH值在7.5～8.5范围内变化时，两种酶酶解南极磷虾的水解度均下降，且木瓜蛋白酶水解效率下降更快，这说明，两种中性蛋白酶酶解南极磷虾时的最高水解度均出现在pH值为7.5而不是中性pH值为7.0，这可能是因为南极磷虾体内存在偏碱性的酶[16]。因此，选择pH值 7.5最为临近的pH值为7.0、7.5和8.0为正交试验的3个指标。

图5 蛋白酶酶解南极磷虾的水解度随pH值的变化

2.2.4 酶添加量对蛋白酶酶解南极磷虾水解度的影响 图6所示，随着蛋白酶添加量的不断增加，南极磷虾酶解率不断升高，且酶添加量为0.1%～0.2%时水解度升高显著；添加量为0.3%～0.4%时，蛋白酶水解南极磷虾的水解度变化不大，其中木瓜蛋白酶的水解效率基本不变。因此，选择0.2%、0.3%和0.4%为正交试验酶添加量的3个指标。

图6 蛋白酶酶解南极磷虾的水解度随酶添加量的变化

2.3 蛋白酶酶解南极磷虾最佳工艺研究条件

由表1和表2可以看出，影响木瓜蛋白酶和枯草杆菌中性蛋白酶水解南极磷虾的各因素的主次顺序均为酶解温度、pH值、酶解时间和加酶量。木瓜蛋白酶水解南极磷虾的最优工艺为酶解温度50℃、pH值 7.5、酶解时间5 h、酶添加量 0.3%，此条件下水解度达（42.17±0.17）%；枯草杆菌中性蛋白酶酶解南极磷虾的最优工艺为酶解温度50℃、pH值 7.5、酶解时间5 h、酶添加量0.4%，水解度达（41.86±0.23）%。由此可知，木瓜蛋白酶对南极磷虾的酶解能力略高于枯草杆菌中性蛋白酶的，但是木瓜蛋白酶水解南极磷虾后的酶解液中脂类悬浮物较多，不易于分离，枯草杆菌中性蛋白酶水解南极磷虾后的酶解液澄清透明易于分离。

表1木瓜蛋白酶酶解南极磷虾L9（34）正交设计方案及试验结果

表2 枯草杆菌中性蛋白酶酶解南极磷虾L9（34）正交设计方案及试验结果

3 结论

试验确定了南极磷虾自溶最适温度为50℃，自溶时间为4 h，自溶水解度为28.63%。单因素试验和正交试验证明添加中性蛋白酶可显著提高南极磷虾水解度，因此可以通过添加中性酶来水解南极磷虾，以实现南极磷虾食用的目的。同时，试验确定木瓜蛋白酶水解南极磷虾的最优工艺为酶解温度50℃、pH值 7.5、酶解时间6 h、酶添加量 0.3%，此条件下水解度达（42.17±0.17）%；枯草杆菌中性蛋白酶水解南极磷虾的最优工艺为酶解温度50℃、pH值 7.5、酶解时间6 h、加酶量0.4%，此条件下水解度达（41.86±0.23）%。

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