紫花苜蓿耐盐种质资源的遗传多样性分析

姜健，杨宝灵，夏彤，于淑梅，乌云娜

（1.大连民族学院环境与资源学院，辽宁 大连116600；2.吉林省农业科学院畜牧科学分院，吉林 公主岭136100）

世界上存在着大面积的盐渍化土地，严重地影响全球农业的发展。长期以来，如何提高作物耐盐性，选育优良耐盐作物新品种，增加盐胁迫条件下农作物产量一直是科学家关注的焦点。筛选作物耐盐种质资源、获得耐盐基因是作物引种、杂交育种、细胞工程育种和基因工程育种的基础和前提。紫花苜蓿（Medicagosativa）作为一种重要的优质蛋白质饲料作物，目前国内外主要在轻度盐渍化土地（土壤盐分浓度＜0.1%）上广泛种植，而中、重度盐渍化土地上种植则受到很大限制［1］，其根本原因在于耐盐种质资源的匮乏，遗传基础狭窄［2］，严重束缚了紫花苜蓿耐盐性的研究和利用。因此，开展紫花苜蓿耐盐性遗传多样性研究，筛选紫花苜蓿耐盐种质资源，对于指导紫花苜蓿耐盐新品种选育，研究紫花苜蓿耐盐性遗传机理具有一定的理论意义。刘春华和张文淑［3］在0.3%和0.4%盐分浓度胁迫下从存活率、相对株高耐盐性、相对干重等6个生物学指标、叶片细胞膜透性和叶片脯氨酸含量2个生理指标对69个苜蓿品种进行耐盐性鉴定。韩清芳等［4］、田瑞娟等［5］也利用各类生物学或生理学指标对苜蓿耐盐种质进行了筛选。近年来，DNA分子标记技术在苜蓿耐盐种质资源筛选鉴定和遗传多样性分析上得到应用，国内外学者先后利用简单序列重复标记（simple sequence repeat，SSR）［6－8］、扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）［9］标记技术对不同耐盐性苜蓿品种进行遗传多样性分析。随机扩增多态性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）技术因其试验简便、快捷，无需预先了解研究对象的DNA序列、DNA多态性检测效率高、基因组覆盖率高，常用于种质资源研究、品种鉴定、多态性分析和抗性辅助育种等方面。本研究利用RAPD技术分析紫花苜蓿耐盐种质的遗传多样性，旨在研究紫花苜蓿耐盐品种间遗传差异，筛选不同类型耐盐亲本，聚合不同耐盐基因，为紫花苜蓿耐盐育种和耐盐性研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料来自大连民族学院环境与资源学院多年收集、鉴定和筛选的25份紫花苜蓿耐盐品种（表1），这些材料在0.8%盐分浓度胁迫条件下，均表现较强耐盐性。其中18份来源于中国，7份来源于美国。试验于2009年进行，以初春幼嫩新叶为试材，每份材料随机选取无性繁殖系个体10株，单株剪取1片健康的嫩叶，3次重复，洗净晾干后置于－70℃冰箱短期保存。

1.2 试验方法

1.2.1 总DNA提取及DNA池建立 采用十六烷基三甲基溴化铵法（hexadecyltrimethy ammonium bromide，CTAB）提取苜蓿基因组 DNA［10］。在提取过程中增加氯仿∶异戊醇（24∶1）沉淀蛋白质处理1次。用琼脂糖凝胶电泳检测所得DNA的完整性，用752－C型紫外分光光度计测定不同波长的光吸收值（OD），进行DNA的纯度和浓度检测，根据浓度测定值用0.1×TE将样品稀释到100ng／μL。利用上述CTAB法进行单株DNA提取，将每份材料的单株DNA逐个保存。同时，将每个品种3个重复单株DNA样品进行同浓度等量混合，建立每个品种的DNA池，置于－70℃冰箱备用。

1.2.2 PCR扩增与检测 扩增总体系为30μL，其中包含50ng模板DNA，5mmol／L MgCl2，40pmol引物，2×buffer，0.5mmol／L dNTP，1.5UTaq酶。热循环参数为：94℃预变性3min，再进入循环，94℃变性15s，36℃退火30s，72℃延伸1min，共45个循环，最后72℃延伸10min，于4℃保存。DNA扩增产物在含有溴化乙锭的1.5%的琼脂糖凝胶中稳压分离，0.5×TBE电泳缓冲液，用λDNA／EcoRI＋HindⅢ为标准分子量Marker，电压100V，电泳2～3h后，用自动凝胶扫描系统检测。

1.2.3 引物筛选 从大连宝生物公司购买1套总计75条RAPD引物，以1个紫花苜蓿品种DNA池为模板，采用优化后的RAPD反应体系进行3轮筛选，筛选出条带清晰的引物，再以筛出的引物对所有试材DNA池进行扩增，进一步筛选出能够扩增品种特异性条带的标记引物。

表1 紫花苜蓿耐盐品种及其来源Table 1 The salt－tolerant alfalfa varieties and its source

1.3 数据分析

对扩增产物的电泳带型以有带（1）或无带（0）进行记录。

1.3.1 遗传多样性分析 多态性位点比率：p＝i／j×100%，i为具有多态性位点数，j为检测到的总位点数。p是衡量一个种群内遗传变异水平高低的重要指标。一个种群多态位点比率高，说明这个种群适应环境能力较强；反之，这个种群适应环境能力较弱，在长期的进化中被淘汰的可能性就越大。

根据各位点带谱出现的频率，计算以下遗传参数［11］：品种内基因一致性：j＝∑Xi2，Xi为第i位点的频率；品种内基因多样性：h＝l－j；品种内基因一致性平均值：Js＝∑j／n，n为品种数；品种内基因多样性平均值：Hs＝1－Js；总基因一致性：JT＝∑（∑Xi／n）2；总基因多样性：HT＝1－JT；基因分化系数：Gst＝（HT－Hs）／HT。

1.3.2 遗传距离及聚类分析 参照Nei和Li［12］的方法计算成对品种间遗传距离GD＝l－2Mxy／（Mx＋My），式中Mx、My分别为x和y材料总片段数，Mxy为两材料公共片段数；组内品种间平均遗传距离GD＝∑（GD）i／［n（n－1）／2］，n为组内品种数。用SAS 8.2软件按类平均（UPGMA）法对 GD进行聚类。

2 结果与分析

2.1 多态性

根据25份紫花苜蓿耐盐种质品种内单株DNA扩增结果筛选引物，筛选引物的标准为：谱带清晰、稳定、可重复性好且有较丰富的扩增带，从75条引物中共筛选出30条RAPD多态性引物，引物序列和扩增结果见表2。单株DNA及混合DNA的部分扩增图谱见图1和图2。

表2 30条RAPD引物对25份紫花苜蓿耐盐品种的扩增结果Table 2 The amplification results of 25salt－tolerant alfalfa varieties with 30RAPD primers

图1 引物OPE－16对AF、CY1、GN1、JD、QX、AG、PE品种单株DNA的RAPD图谱Fig.1 The patterns of RAPD amplification by primer OPE－16with single plant DNA of AF，CY1，GN1，JD，QX，AG and PE 8varieties

图2 引物OPE－16对AF、CY1、GN1、JD、QX、AG、PE品种混合DNA的RAPD图谱Fig.2 The patterns of RAPD amplification by primer OPE－16with blend DNA of AF，CY1，GN1，JD，QX，AG and PE 8varieties

30个引物在25份耐盐紫花苜蓿单株DNA间共扩增出433条谱带，其中353条谱带为多态性谱带，多态性位点比率为81.52%，表明各品种间已经产生了遗传分化，具有较高的遗传变异水平和较强的环境适应能力。而30个引物对各品种混合DNA共扩增出279条谱带，多态性谱带为172条，多态性位点比率为61.65%。各品种混合DNA的多态性明显低于各品种单株DNA的多态性，说明混合DNA掩盖了品种内的DNA多态性，导致品种间多态性降低。因此，针对异交植物紫花苜蓿来说，采用单株DNA样品比采用混合DNA样品能更好地揭示出品种内和品种间的遗传变异水平，而且能够定量分析品种间的差异。

在全部供试材料中，各引物间DNA扩增的谱带数差异较大，对单株DNA扩增的谱带数为4～26条，平均为14.43条，对混合DNA扩增的谱带数为2～17条，平均为9.30条，说明不同引物与供试材料DNA部分区域的同源性有较大差异。对2种DNA样品来说，引 物 OPA－17、OPD－05、OPD－12、OPE－06、OPE－08、OPE－09、OPE－16、OPF－13等均具有较多的扩增带数和较高的多态性性位点比率，能显示出紫花苜蓿属某些品种的特性，可以作为这些品种的特征带。30条DNA引物反应出各品种间遗传多态性差异较大，说明各供试材料在DNA序列上存在一定差异，也说明RAPD技术非常适合用于紫花苜蓿遗传多样性研究。

表3 耐盐紫花苜蓿品种单株DNA的遗传差异Table 3 The genetic differences of single plant DNA of salt－tolerant alfalfa varieties

2.2 遗传变异

对来源于中国的18个耐盐紫花苜蓿品种和来源于美国的7个耐盐紫花苜蓿品种的单株DNA样品分别作遗传变异分析，统计结果表明，在中国18个耐盐紫花苜蓿品种中，图牧2号的多态性位点比率最高（p＝73.80%），最低为肇东苜蓿（p＝48.36%）；从基因多样性上看，图牧2号为最高（h＝0.352），最低为公农1号（h＝0.225）。在美国7个耐盐紫花苜蓿品种中，Peruvian的多态性位点比率最高（p＝71.24%），最低为Chilean（p＝50.26%）；从基因多样性上看，Az90ncc－St为最高（h＝0.357），最低为Alfaking（h＝0.265）。

中国18个耐盐紫花苜蓿品种的总基因多样性（HT＝0.398）要略大于美国7个耐盐紫花苜蓿品种的总基因多样性（HT＝0.355）（表3），说明中国耐盐紫花苜蓿品种资源要比美国耐盐紫花苜蓿品种资源更加丰富。基因分化系数（Gst）主要反应品种间变异占总变异的比例，2组的基因分化系数分别为0.271和0.152，一方面说明紫花苜蓿耐盐种质资源的遗传变异主要存在于品种内，而非品种间，另一方面说明中国耐盐紫花苜蓿种质资源品种间基因交流机会比美国品种间交流机会多。上述结果表明，紫花苜蓿作为典型的异交植物，其生物群体的遗传结构与其繁育体系有直接的联系。

2.3 聚类分析

根据Nei距离，按类平均法（UPGMA）对25个品种进行聚类（图3），在0.80阈值下，全部供试材料分为9组。龙牧801、龙牧803、公农2号3个品种为第Ⅰ组；草原1号、草原2号、乾县、中苜1号4个品种为第Ⅱ组；图牧1号、图牧2号、亮苜5号、敖汉1号、敖汉2号、肇东6个品种为第Ⅲ组；甘农3号、公农1号、Alfaking、新疆大叶4个品种为第Ⅳ组；Az－Germsalt、Az90ncc－St、Peruvian、WL3－23四个品种为第Ⅴ组；Chilean、艾菲尼特、Super13R、捷达分别为第Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ和Ⅸ组。在9个组群中，第3组各品种间遗传距离最小，各品种间亲缘关系最近，说明在同一地域分布的紫花苜蓿品种之间亲缘关系较近。25个品种中图牧1号和图牧2号遗传距离最小（GD＝0.148），其次为敖汉1号和敖汉2号（GD＝0.182）；捷达和图牧1号遗传距离最大（GD＝0.786）。

图3 基于RAPD标记的25份耐盐紫花苜蓿种质的聚类图Fig.3 The clustering dendrogram of the 25salt－tolerant alfalfa varieties based on RAPD markers

3 讨论

RAPD技术因其试验简便、快捷，无需预先了解研究对象的DNA序列，对DNA多态性检测效率高，常用于抗性辅助育种、多态性分析、种质资源研究、品种鉴定等方面。但由于该技术体系对反应物浓度变化敏感，所以其结果稳定性不佳，而且在牧草遗传信息鉴定方面研究较少。Etch等［13］对二倍体紫花苜蓿的回交群体进行了RAPD分析，认为像紫花苜蓿这样遗传信息了解的非常少或某些遗传信息很难获得的物种，利用RAPD标记可以较快地掌握部分遗传信息，这无疑对育种和种质资源的鉴定具有重要意义。Yu和Pauls［14］利用RAPD技术对紫花苜蓿品种的亲缘关系和品种的杂合性进行了分析，认为RAPD标记可为杂合群体间亲缘关系的分析和杂交育种中为获得最大的杂交优势而合理选择亲本提供大量有用的遗传信息。本研究利用30个引物很好地揭示出25个耐盐紫花苜蓿品种的品种内和品种间的遗传变异水平以及国内外紫花苜蓿耐盐品种的遗传结构和遗传距离，由此可见，RAPD技术在迅速获得紫花苜蓿遗传信息方面具有很高的利用价值。

Yu用筛选出的10条特异性RAPD引物，在每个品种（群）中取10个单株，就可以区分18～72个品种（群）［14］。杨晓莉等［15］利用品种内混合DNA分析了甘肃省苜蓿种质资源遗传多样性，所筛选的10个引物的扩增的带中没有出现品种特异性带，分析认为RAPD标记为显性标记，因其重复性、稳定性和特异性较差所造成。本研究对单株DNA样品和混合DNA样品RAPD扩增结果差异表明，品种内和品种间均存在明显的多态性，混合DNA样品分析掩盖了品种内的多态性，品种间的多态性明显降低。针对异交植物紫花苜蓿来说，采用单株DNA样品比采用混合DNA样品能更好地揭示出品种内和品种间的遗传变异水平，而且能够定量分析品种间的差异。

近年来，国内外有关紫花苜蓿耐盐性的研究主要集中在耐盐品种筛选、耐盐性混合选择等方面。马春平和崔国文［16］、刘卓等［17］研究表明，紫花苜蓿品种间及品种内均存在显著差异，具有通过选择增加其耐盐性的遗传潜力，可以在不同地区具有广泛遗传特异性的品种间筛选出比较耐盐的品种。从聚类图（图3）上显示，25个紫花苜蓿耐盐种质中大多数来自同一地区的品种（品系）基本分在同一组里。王赫等［18］、毛培胜等［19］在研究苜蓿遗传多样性时也得到了相同的结论，即来自不同地区的品种（品系）大部分按地理来源分为一类，这主要是由于来源于同一地区供试材料长期按照当地的育种目标定向育种，遗传基础日益狭窄，因此遗传多样性程度必然较小。但在本研究第4组群中，公农1号和Alfaking遗传距离最近，公农1号是1922年从美国引进的“苜蓿王”苜蓿品种经过连续四代选育出来的，又在吉林省公主岭经过26年的大面积驯化筛选，在基因来源上与美国Alfaking相似，说明紫花苜蓿耐盐种质资源遗传多样性不但与地理位置相关，而且与亲本血缘关系紧密相关。中国吉林来源的艾菲尼特和捷达2个品种与国内其他品种的遗传距离较远，而与美国7个品种的遗传距离较近，说明这2个品种极可能为引进美国品种进行驯化筛选或者与引进品种进行杂交所选育出的新品种。

紫花苜蓿耐盐种质具有一定的遗传多样性，耐盐性属于数量性状，受多基因控制，不同的耐盐基因控制和表达的时期也不同。因此，分析紫花苜蓿耐盐基因遗传多样性，有针对性地选用非等位耐盐基因的紫花苜蓿品种作为亲本材料，配置杂交组合，获得耐盐基因聚合的品种，可以提高种质资源的利用率和育种效率，推动紫花苜蓿耐盐育种和紫花苜蓿生产。

［1］Khorshidi M B，Yarnia M，Hassanpanah A.Salinity effect on nutrients accumulation in alfalfa shoots in hydroponic condition［J］.Journal of Food Agriculture ＆Enviroment，2009，7（3）：787－790.

［2］Jin H C，Sun Y，Yang Q C，etal.Screening of genes induced by salt stress from alfalfa［J］.Molecular Biology Reports，2010，37（2）：745－753.

［3］刘春华，张文淑.六十九个苜蓿品种耐盐性及其二个耐盐生理指标的研究［J］.草业科学，1993，10（6）：17－22.

［4］韩清芳，李崇巍，贾志宽.不同苜蓿品种种子萌发期耐盐性的研究［J］.西北植物学报，2003，23（4）：597－602.

［5］田瑞娟，杨静慧，梁国鲁，等.不同品种紫花苜蓿耐盐性研究［J］.西南农业大学学报（自然科学版），2006，28（6）：933－936.

［6］Diwan N，Bhagwat A A，Bauchan G R，etal.Simple sequence repeat（SSR）DNA markers in alfalfa and perennial and annumMedicagospecies［J］.Genome，1997，40：887－895.

［7］Mengoni A，Ru ni C，Vendramin G，etal.Chloroplast microsatellite variation in tretaploid alfalfa［J］.Plant Breeding，2000，119：509－512.

［8］刘志鹏，杨青川，呼天明，等.用SSR标记研究不同耐盐特性四倍体紫花苜蓿的遗传多样性［J］.作物学报，2006，32（4）：630－632.

［9］Bernadette J，Sandrine F，Philippe B，etal.Construction of two genetic linkage maps in cultivated tetraploid alfalfa（Medicago sativa）using microsatellite and AFLP markers［J］.BMC Plant Biology，2003，3：9－12.

［10］顾红雅，瞿礼嘉.植物分子生物学实验手册［M］.北京：高等教育出版社，1998：6－10.

［11］Nei M.Molecular population genetics and evolution［J］.Frontiers of Biology，1975，40：127－174.

［12］Nei M，Li W H.Mathematical model for studying genetical variation in terms of restriction endonucleases［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA，1979，74：5267－5273.

［13］Etch C S，Erdahl L M，Mccoy T J.Genetic segregation of random amplifield polymorphic DNA in diploid cultivated alfalfa［J］.Genome，1992，35：84－87.

［14］Yu K F，Pauls K P.Rapid estimation of genetic relatedness among heterogenous populations of alfalfa by random amplification of bulked genomic DNA samples［J］.Theoretical and Applied Genetics，1993，86：788－794.

［15］杨晓莉，陈丽，班霆，等.甘肃省苜蓿种质资源遗传多样性RAPD分析［J］.草地学报，2008，16（2）：129－134.

［16］马春平，崔国文.10个紫花苜蓿品种耐盐性的比较研究［J］.种子，2006，25（7）：50－53.

［17］刘卓，徐安凯，王志锋.13个苜蓿品种耐盐性的鉴定［J］.草业科学，2008，25（6）：51－55.

［18］王赫，刘利，周道玮.苜蓿属种质资源遗传多样性RAPD分析［J］.草地学报，2007，15（5）：438－441.

［19］毛培胜，张涛，杨青川.紫花苜蓿品种鉴定的RAPD分子标记技术研究［J］.草地学报，2007，15（2）：125－128.