ECLIA法与RRA法检测血清促甲状腺激素受体抗体的对比研究

彭鸣亚 徐龙宝 邓民斌 薄静莉 杨其贤

（常州市第二人民医院核医学科，江苏 常州 213003）

Graves病（Graves disease，GD）是一种器官特异性自身免疫性疾，是在环境因素与遗传因素相互作用下，机体免疫统对自身成分发生免疫应答而导致的疾病状态，GD时体内存在多种自身抗体，如促甲状腺激素受体抗体（TRAb）、甲状腺球蛋白抗体（TgAb）、甲状腺过氧化物酶抗体（TPOAb）等，而在GD患者中TRAb的阳性率能达到95%以上，其在GD发病机制中起着关键的作用，因此准确检测患者血清TRAb显然有助于甲状腺疾病的鉴别诊断，并对Graves病疗效评价及病程监测和预后有重要的价值。长期以来，临床上血清TRAb的检测基本采用放射受体分析方法（RRA）或ELISA这两种手工检测方法，虽然这两种方法具有结果较精确，经济成本低等优点，但也存在检测耗时较长，操作过程不可控因素相对比较多，检测的质量控制相对不稳定，对操作者技术要求较高等制约因素。近来，罗氏诊断公司已采用全自动电化学发光免疫方法（ECLIA）检测TRAb，其显著的优点是操作简便、快捷。国际多中心研究报告提示该方法也有较高的诊断灵敏度和特异性[1]。本文拟将ECLIA与天津协和医药科技有限公司提供的RRA试剂进行对比分析，以验证ECLIA法检测TRAb的可行性和临床实用性。

1 对象与方法

1.1 对象

正常对照组158例，其中男51例，女107例。年龄范围18～83岁，均为健康体检者，无甲状腺疾病史，实验室甲状腺功能检查均正常。Graves病组159例，其中男49例，女110例，年龄范围16～82岁，均为门诊初诊患者，实验室甲状腺功能检查均异常。

1.2 方法

ECLIA采用Roche Cobas600全自动电化学发光免疫分析系统及配套试剂（罗氏诊断公司，德国）。检测原理为：通过一种生物素标记的抗猪促甲状腺激素受体（TSHR）小鼠单克隆捕获抗体，将可溶猪TSHR固定于链霉亲和素包被的微粒上，捕获抗体结合于猪TSHR的C末端，不会干扰TRAb或人TSHR刺激单克隆抗体（M22）与TSHR的结合，通过检测TRAb抑制钌标记M22结合TSHR的能力进行测定。实验所需的样本容量为50μL，总体实验时间27min。测定范围0.3～40IU/L。

RRA方法检测采用天津协和医药科技有限公司提供的RRA试剂盒，检测原理为：由于TRAb能阻碍TSH与TSH受体的结合，因此将TSH受体与血清125I-TSH标记物一起温育，TRAb与标记物竞争结合受体的部位，因此若TRAb滴定度较高，则125I-TSH结合受体就较低。温育后加入沉淀剂使受体-标记物复合物沉淀，离心后弃上清，测量沉淀物的放射性强度从而得出TRAb的值。实验所需的样本容量为50μL，总体实验时间3h。测定范围0.5～40.5IU/L。

所有受检者均以血清管采清晨空腹静脉血3mL，待血液凝固后分离血清，2～8℃保存，并于48h内采用ECLIA和RRA两种方法检测TRAb，同一份血清分别采用双管检测后取其平均值作为检测值。

取低浓度与高浓度TRAb血清样本，分别以ECLIA和RRA方法重复测定10次，计算各自测量值、标准差及变异系数。

1.3 统计学处理

采用SPSSl3.0统计软件，计算正常人群的第97.5百分位数（P97.5）作为TRAb正常参考值的上限，根据该值对样本进行阴阳性分类，差异性比较采用McNemar检验，两种检测方法所得结果之间采用Wilcoxon配对比较，相关分析采用Spearman秩相关。

2 结 果

2.1 诊断符合率

取正常对照组者检测结果的P97.5作为TRAb正常参考值的上限，ECLIA法与RRA法分别为1.37IU/L与2.01IU/L，以此对159对甲状腺功能亢进患者的检测结果进行阴阳差异性分类，结果见表1，两种检测方法均呈阳性为127例，（占ECLIA总阳性的94.8%）均呈阴性为20例（占ECLIA总阴性的80.0%），ECLIA阳性而RRA阴性7例，ECLIA阴性而RRA阳性5例，总诊断符合率86%，McNema分类差异P=0.896，无统计学意义，分类一致性Kappa值为0.845（P＜0.01）。结果说明两种检测方法的检测结果对临床判断虽有差异，但整体判断较一致，影响不大。

表1 两种方法检测结果

2.2 两种方法检测TRAb值的相关性

两种检测方法对所有实验血清样品TRAb对比检测结果显示：Roche ECLIA的TRAb检测数值明显低于RRA检测值，经统计学处理后得出两种方法Wilcoxon配对检验Z值为－9.258（P＜0.01），提示两种方法的检测值之间存在统计学差异，但两种方法得出的检测值的Spearman相关系数为0.792（P＜0.01），提示两种TRAb检测方法的整体相关性良好。

2.3 精密度

选取TRAb低浓度血清（ECLIA法检测值为1.98IU/L，RRA法检测值为2.45IU/L）与TRAb高浓度（ECLIA法检测值为29.8IU/L，RRA法检测值为31.2IU/L）重复测量10次，计算各自的变异系数，ECLIA法：低浓度TRAb的变异系数：3.7%，高浓度TRAb的变异系数：1.2%。RRA法：低浓度TRAb的变异系数：12.7%，高浓度TRAb的变异系数：7.4%。ECLIA法检测TRAb的稳定性较RRA法明显好，且两种方法在检测血清高浓度TRAb的稳定性均较检测血清低浓度TRAb好。

3 讨 论

血清TRAb的浓度，对GD引起甲状腺外表现和其他甲状腺疾病的诊断、评估疗效、确定停药时机、预测复发及鉴别高危人群等方面又中药的临床意义，因此，TRAb的检测方法直接影响着临床对甲状腺疾病的判断、治疗等，目前TRAb的检测方法主要有两类，即受体分析法及生物分析法[2]。临床上应用较广的是RRA法和ELISA法，而这两种方法均存在检测速度慢，人为影响因素多等实际问题，罗氏公司基于生物分析法的原理，将TRAb纳入ECLIA系统，去除了人为影响因素，并缩短了检测时间，提高了检测效率。

本研究结果显示：RRA法与ECLIA法在检测同一份血清TRAb时，检测值有明显的差异，产生这种差异性的原因很多，考虑以下因素最有可能：TRAb本身属于多克隆混合抗体性质，两种方法所选择的TSHR来源不同，免疫结合在识别位点上不同，由此造成检测结果形成差异，因此，在使用不同方法检测血清TRAb时，有必要确定不同方法的正常参考值，否则，则有可能对患者个体检测结果产生显著影响，这一点应引起实验室和临床医师的重视。当临床判断预期与实验室TRAb分析结果相矛盾时，除进行必要的误差分析外，尚需注意其正常参考值的设定是否正确。

由于加样准确、检测条件稳定等多种因素，自动化检测的优势之一在于免疫检测的精密度和稳定性比手工方法好[3]，本研究的结果也证实了这一点。在进行的简化批内误差分析实验中，我们注意到无论是低值还是高值，ECLIA批内变异系数均较RRA法小，显示出ECLIA法在精密度和稳定性方面的优异表现。

由于实验条件限制，本研究局限性在于尚没有对ECLIA检测TRAb进行系统性的回收率测定，由于ECLIA和RRA方法对TRAb的有效检测量程均有限（分别为＜40IU/L及＜40.5IU/L），因此临床上经常出现患者TRAb血清浓度高出测量上限（本研究中包含13个病例），因此，在遇到这种情况时，需要对样品进行稀释后进行检测，而免疫检测中高浓度样品的稀释往往不成线性，因此常无法判断GD病的危险度和对治疗效果进行监测，因此，若能进一步实验证实ECLIA法的回收率较高，则能进一步显示ECLIA法的优势。

由于时间限制，本研究的其他局限性还包括在标本的收集方面不太完善，未能获得甲状腺功能亢进患者全面的诊断和治疗随访的全面信息，同时对于临床判断的正常参考值仅限于为本研究的表面健康人群，未经过大样本的临床研究得到最终确定。至于血清内其他成分如甲状腺球蛋白抗体（TGAb）和甲状腺过氧化物酶抗体（TPOAb）等因素对TRAb检测值的影响也需要实验室验证。

无论如何，采用ECLIA检测TRAb的方法学优势显著。该方法检测速度快，整个检测过程不超过30min，能使患者和临床医生快速取得检测结果，为临床治疗提供即刻信息。临床实验室采用免疫自动化方法检测TRAb将成为一种趋势[4]。

[1] Sehott M,Hermsen D,Broecker-Preuss M,et a1.Clinical value of the first at Jtol/I,tlted TSH receptor a atoantibody assay for the diagnosis of Groves’ disease(GD):an international muhieentre tRRAl[J].Clin Endocrinol,2009,71(8):566-573.

[2] 周亚芹,苏青.促甲状腺素受体抗体的检测方法[J].放射免疫学杂志,2009,22(1):40-43.

[3] Yoshimura NJ,Miyazaki N,Ito K,et a1.Evaluation of a new rapidand fully automated electrochemiluminescence immunoassay for thyrotropin receptor autoantibedies[J].Thyroid,2009,18(10):1157-1164.

[4] Hermsen D,Broecker-Preuss M,Casati M,et a1.Technical evaluation of the firstfully automated assay for the detection of TSH receptor autoantibodies[J].Clinica Chemiea Acts,2009,40(1/2):84-89.