羧胺三唑与小剂量地塞米松合用对A549肺癌移植瘤生长抑制作用的研究

鞠瑞，武丹威，郭磊，李娟，叶菜英，张德昌

非细胞毒抗肿瘤药物羧胺三唑（carboxyamidotriazole，CAI）具有抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡和抑制血管形成等作用[1-3]。而我们在之前的研究中新发现 CAI 在一系列急慢性炎症模型中表现出抗炎作用，能够显著抑制炎症介质——肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的释放[4]。因此在本文中，我们首先提出了 CAI 对肿瘤环境中 TNF-α 也有调控作用的假设。TNF-α 不仅是炎症反应中十分重要的一种细胞因子，在肿瘤发生阶段和侵袭转移阶段也扮演促进肿瘤发展的关键角色，是促进血管形成的一种重要的细胞因子，血管内皮生长因子（VEGF）的表达也依赖于 TNF-α 的调控[5]。地塞米松（dexamethasone，DEX）是一种皮质类固醇药物，具有很强的抗炎作用，能抑制巨噬细胞分泌包括TNF-α 在内的多种炎性细胞因子，在肿瘤的治疗中也十分常见[6]。在本项研究中，我们研究了 CAI 与小剂量 DEX 联合应用（combination，COM）是否能增强 CAI 对移植瘤生长的抑制作用以及是否能进一步降低 TNF-α 在肿瘤环境中的含量；给予TNF-α 特异性拮抗剂——英夫利昔单抗（TNF-α antibody，TAB）研究 TNF-α 在该模型肿瘤生长中的作用；并对肿瘤组织内的血管用 CD31 抗体进行染色以初步解释药物作用。目前的 CAI 单独应用或与化疗药物合用的临床试验数据表明，CAI 治疗肿瘤的疗效并不理想，合并用药方案也未能有效地使抗肿瘤作用增强[7-9]。优化 CAI 的抗肿瘤作用和发展新的联合用药方案具有重要意义。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系 A549 肺癌细胞购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心。

1.1.2 实验动物 40 只 6～8 周龄裸小鼠，体重18～20 g，合格证号：0156072，购自中国医学科学院动物所。在温度（22±2）℃、湿度 40%～70%、每日12 h 光照环境下饲养。

1.1.3 试剂 CAI 由中国医学科学院药物研究所提供；聚乙二醇 400（PEG 400）购自北京化学试剂公司；DEX 购自天津金耀氨基酸有限公司；RPMI1640 培养基购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心；胎牛血清购自美国 Gibco 公司；CD31 抗体（MEC13.3）购自美国 Biolegend 公司；OCT 包埋剂、FITC 标记的山羊抗大鼠 IgG 二抗购自北京中衫金桥生物技术有限公司；TNF-α ELISA 检测试剂盒购自美国 R&D 公司。

1.1.4 实验仪器 ThermoForma Series II 水套CO2培养箱购自美国 Thermo 公司；CM1900 型冰冻切片机和 DM5000B 型荧光显微镜均购自德国徕卡公司；Synogen 4 酶标仪购自美国基因公司。

1.2 方法

1.2.1 体外细胞培养 A549 细胞用 RPMI1640培养基（加入 10%胎牛血清、1%L-谷氨酰胺、50 mg/ml 青霉素和 100 mg/ml 链霉素）在 37℃、5%CO2环境中培养。

1.2.2 A549 移植瘤模型 收集处于对数生长期的 A549 细胞，用 PBS 调整细胞密度至 2×107个/ml，向每只裸小鼠右侧腋窝内注射 0.1 ml，即 2×106个/只。接种后将小鼠随机分为5 组：溶剂 PEG 400 组、CAI 组、DEX 组、CAI 与 DEX合用（COM）组和英夫利昔单抗（TAB）组，每组8 只小鼠。接种 A549 细胞后第2 天给药：PEG 400 组和 CAI 组小鼠每天灌胃给药一次，0.1 ml/10 g 体重，CAI 剂量为20 mg/kg；DEX 组每周背部皮下注射给药两次，剂量为1 mg/kg；CAI 和DEX 合用组给药方式和剂量为：CAI 每天灌胃给药一次，剂量为20 mg/kg，DEX 每周背部皮下注射给药两次，剂量为1 mg/kg；英夫利昔单抗每周腹腔注射给药两次，剂量为10 mg/kg。给药 40 d后处死小鼠，剥离肿瘤组织并称重。将一部分肿瘤组织浸入 OCT 包埋剂，在液氮液面上方冻成硬块，保存于 –80℃，以备制成冰冻切片；将一部分肿瘤组织保存于 –80℃，以备匀浆。

1.2.3 肿瘤组织 CD31 血管染色 将 OCT 包埋的肿瘤组织用冰冻切片机制成 8 μm 冰冻切片，将切片立即置于甲醇中固定 2min 后浸于 pH 7.4 PBS 中清洗，之后滴加 5%牛血清白蛋白（BSA）在 37℃孵育 40min。用 pH 7.4 PBS 清洗后滴加大鼠抗小鼠 CD31 一抗（1∶200 稀释）孵育，4℃过夜。第2 天将切片在室温平衡 1 h 后，用 pH 7.4 PBS 清洗 5min 并重复 3 次，然后滴加 FITC 标记的山羊抗大鼠 IgG 二抗，室温避光孵育 2 h 后，用 pH 7.4 PBS 清洗，5min×3。封片后用荧光显微镜观察照相。

1.2.4 肿瘤组织内 TNF-α 含量检测 每组取4 个肿瘤组织，在液氮冷冻条件下用研钵将肿瘤组织研磨成粉末，然后收集于试管中称重，按 500 μl/g组织的比例向粉末中加入放射免疫沉淀裂解液（radio immuno precipitation assay，RIPA），其中含苯甲基磺酰氟（PMSF）1mmol/L、二硫苏糖醇（DTT）1mmol/L、亮抑酶肽（leupeptin）5 μg/ml、抑蛋白酶肽（aproptinin）5 μg/ml，置冰上使用组织匀浆器匀浆 30 s，将组织悬液在 4℃以 15 000×g超速离心 30min。取离心上清，用 Bradford 方法对总蛋白进行定量。用 ELISA 试剂盒检测肿瘤组织蛋白匀浆中 TNF-α 的浓度，用 TNF-α 浓度/总蛋白浓度表示 TNF-α 在肿瘤组织蛋白匀浆中的含量。

1.3 统计学处理

应用 SPSS13.0 统计学软件进行数据处理，对照组与给药组检测结果的比较采用 Student’st检验，以P＜0.05 为有统计学意义的差异。

2 结果

2.1 CAI 和（或）DEX 对 A549 移植瘤生长的抑制作用

A549 移植瘤模型建立 40 d 后，处死小鼠并剥离瘤组织，发现药物合用组的肿瘤组织体积明显小于溶剂对照 PEG 组（图1）。各组瘤重分别为：PEG 组（0.23±0.04）g；CAI 组（0.21±0.02）g；DEX 组（0.17±0.04）g；COM 组（0.12±0.03）g；TAB 组（0.17±0.04）g（图2）。CAI 与 DEX 合用使瘤重降低了 49.1%。

图1 A549 移植瘤模型建立 40 d 后剥离的 PEG 组和COM 组的肿瘤组织，分别取 PEG 组和 COM 组 4 个肿瘤组织进行照相Figure 1 Tumor tissues isolated after 40 days of treatment in the A549 xenograft tumor model, 4 tumor tissues in PEG or COM group were taken for photos

图2 A549 移植瘤模型建立 40 d 后各组瘤重，给药 40 d后处死小鼠，剥离肿瘤组织并称重（n = 8）。*，与 PEG 组相比P＜0.01Figure 2 Tumor weights after 40 days of treatment in the A549 xenograft tumor model.The tumors were isolated and weighed after 40 days of treatment (n = 8).*,P＜0.01,compared with PEG group.

2.2 CAI 和（或）DEX 对 A549 移植瘤组织内血管生成的抑制作用

我们对各组肿瘤组织冰冻切片进行 CD31 荧光染色观察血管数目的变化，发现 CAI 和 DEX均能减少血管生成，而药物合用组中的血管数目被降至更低水平（图3）。

图3 各组肿瘤组织内血管染色，将肿瘤组织 8 μm 冰冻切片用大鼠抗小鼠 CD31 一抗和 FITC 标记的山羊抗大鼠IgG 二抗依次孵育，封片后用荧光显微镜观察照相（10×）（A：PEG；B：CAI；C：DEX；D：COM）Figure 3 Immuno-fluorescent staining for CD31 in tumor tissues.The frozen sections (8 μm) were incubated with anti-mouse CD31 primary antibody and followed by FITC-conjugated second antibody.The photos were captured by a fluorescent microscope (10×) (A: PEG; B: CAI; C: DEX;D: COM)

2.3 CAI 和（或）DEX 降低 A549 移植瘤组织TNF-α的含量

我们对各组肿瘤组织匀浆中 TNF-α 的含量进行了测定。PEG、CAI、DEX、COM 和 TAB 组肿瘤组织匀浆中 TNF-α 的含量分别为（933.9±286.8）、（636.1±157.4）、（684.9±170.1）、（364.7±0.1）和（606.8±190.3）pg/mg 蛋白（图4）。结果显示，CAI 和 DEX 单用均可下调 TNF-α 的含量，两药合用使 TNF-α 含量降至更低的水平。

图4 各组肿瘤组织内 TNF-α 的含量。*，与 PEG 组相比P＜0.01Figure 4 TNF-α concentration in tumor tissues.*,P＜0.01,compared with PEG group.

3 讨论

本项研究表明，羧胺三唑（CAI）不仅能够直接影响肿瘤细胞[抑制增殖、诱导凋亡、抑制肿瘤细胞中血管内皮细胞生长因子（VEGF）的生成等]，还能通过调控肿瘤环境中 TNF-α 控制肿瘤的发展。DEX 具有抗炎作用，对 TNF-α 的合成有较强的抑制作用，与 CAI 合用后使其抗肿瘤作用增强。

CAI 和 DEX 均能在一定程度上抑制 A549移植瘤的生长，合用之后的抗肿瘤作用被显著增强。我们在该移植瘤生长过程中给予 TNF-α 抗体药物英夫利昔单抗，发现拮抗 TNF-α 能够使肿瘤生长减缓。一些临床试验数据确实表明，英夫利昔单抗能够稳定晚期癌症患者的病情，其单独应用和与化疗药物合用均取得了良好的疗效[10-12]。针对促肿瘤发展细胞因子 TNF-α 进行抗肿瘤治疗被广泛认可[13]。

TNF-α 在肿瘤的发生发展过程中作用较广，目前研究较多的是其促血管生成作用。在肿瘤微环境中，TNF-α 可能能够使骨髓系祖细胞向内皮细胞分化[14]，VEGF 的变化也依赖于 TNF-α 的调控[5]。我们对 A549 移植瘤组织的冰冻切片进行血管染色后发现，CAI 能抑制血管的生成，这与目前文献[15]报道的 CAI 的血管抑制作用一致。由于在之前的研究中发现 CAI 在急慢性炎症中均表现出对TNF-α 释放的抑制作用，我们提出了 CAI 也能够调控肿瘤环境中 TNF-α 含量的假设。对肿瘤组织中 CD31 分子染色，观察各组血管数目的差异，结果显示 CAI 和 DEX 单用均能减少血管的数目，这与目前对两种药物的认识一致：CAI 能够抑制肿瘤细胞 VEGF 的释放，而 DEX 也在多种模型上被发现具有抗血管生成作用，如能够通过抑制 H22肝癌细胞中 VEGF 的表达抑制 H22 移植瘤的生长[16]。我们在本实验中发现两者合用组的血管数目降至极低的水平。由于两种药物均具有抗炎作用，且 VEGF 的表达受到 TNF-α 的调控，我们对各组肿瘤组织内 TNF-α 的含量进行了检测。结果显示，CAI 和 DEX 确实都对肿瘤组织内的 TNF-α 有下调作用，而两者合用对其抑制作用最为明显，其含量水平甚至低于英夫利昔单抗给药组。各组TNF-α 含量的差异与各组瘤重的差异吻合。

总之，本实验发现了小分子药物 CAI 与小剂量DEX 合用之后对肿瘤环境中 TNF-α生成和 A549移植瘤生长的强抑制作用，其作用可与 TNF-α 特异性拮抗剂英夫利昔单抗相比，甚至优于后者。在给药过程中，始终没有发现糖皮质激素相关的不良反应，此合用方案有着良好的耐受性。本项研究对于优化 CAI 的抗肿瘤作用有着重要的意义，并为肺癌治疗提供了一种可能的联合用药方案。

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