正交设计法优选香白通络巴布膏药材的提取方法

张 钦 任世禾

（上海中医药大学附属市中医医院，200071）

正交设计法优选香白通络巴布膏药材的提取方法

张 钦 任世禾

（上海中医药大学附属市中医医院，200071）

@香白通络巴布膏药；正交设计法

香白通络巴布膏由白芥子、乳香、冰片等药物组成，由本院脑病科根据多年临床实践组方而成，具有祛风通络、牵正口之功效，用于穴位敷贴治疗面瘫，疗效显著。白芥子为方中君药，取其祛风通络、化痰散结之功效，文献资料［1-2］表明白芥子、乳香的主要活性成分适宜于乙醇提取。本文拟采用正交设计法，以白芥子中主要成分芥子碱硫氰酸盐的含量及提取物浸膏得率为考察指标，优选药材的最佳乙醇回流提取工艺条件，为合理提取药物的有效成分提供理论依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 1200 HPLC series，Degasser G1322A，QuatPump G1311A，TCC G1316A，DAD G1315D色谱仪（美国安捷伦公司）；SK7210HP型超声波洗涤机（上海科岛超声仪器有限公司）；HWS-11型电热恒温水浴锅（上海慧泰仪器有限公司）；RE52AA旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。

1.2 试药 白芥子（批号：LY09110023，产地：甘肃）、乳香（批号：100304，产地：埃塞俄比亚）药材取自本院中药房，符合《中国药典》2010年版一部的有关规定。乙腈色谱纯（上海强顺化学试剂有限公司），磷酸二氢钾分析纯（天津永大化学试剂）。芥子碱硫氰酸盐对照品（中国药品生物制品检定所，批号：111702-200501），重蒸馏水（实验室自制）。

2 方法及结果

2.1 芥子碱硫氰酸盐含量测定

2.1.1 色谱条件 参照有关文献［3］，以乙腈（流动相A）-0.08mol/L磷酸二氢钾溶液（流动相B）为流动相。实验比较了流动相A∶流动相B=30∶70及20∶80两种不同比例流动相系统对峰形的影响，结果显示当流动相A∶流动相B=30∶70时，出峰时间较早，峰形较好，图谱见图1、2。确定色谱条件：资生堂C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相为乙腈∶0.08mol/L磷酸二氢钾溶液=30∶70；流速1.0mL/ min；柱温为室温；进样量20μL；检测波长326nm。

2.1.2 溶液的制备 对照品溶液的制备：精密称取芥子碱硫氰酸盐标准品（五氧化二磷干燥器中减压干燥48h）5.0mg，置25mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，得到浓度为0.2mg·mL-1的对照品溶液。供试品溶液的制备：取白芥子、乳香粗粉各10g，加6倍量50%乙醇浸渍30min，80℃回流2h，减压浓缩至干浸膏。取浸膏适量，加流动相溶解，30℃超声10min，定容至10mL，过0.45μm微孔滤膜，作为供试品溶液。

图1 芥子碱硫氰酸盐对照品HPLC色谱图，流动相为乙腈∶0.08mol/L磷酸二氢钾溶液=30∶70

图2 芥子碱硫氰酸盐对照品HPLC色谱图，流动相为乙腈∶0.08mol/L磷酸二氢钾溶液=20∶80

2.1.3 线形关系考察 精密吸取“2.1.2”项下的对照品溶液2、3、4、5、6mL，以流动相稀释并定容至10mL，配制成浓度分别为0.04mg·mL-1、0.06mg· mL-1、0.08mg·mL-1、0.10mg·mL-1、0.12mg·mL-1的标准品溶液，过0.45μm微孔滤膜。注入液相色谱仪分析。以峰面积积分值为纵坐标，进样浓度（mg· mL-1）为横坐标绘制标准曲线，得回归方程Y= 38041.3974+192.0128，r=0.9957，在0.04mg·mL-1～0.12mg·mL-1范围内，线性关系良好。

2.1.4 精密度试验 精密吸取同一对照品溶液20μL，重复进样6次，测定芥子碱硫氰酸的峰面积。结果峰面积平均值为4539.2，RSD=0.89%，表明仪器精密度良好。

2.1.5 稳定性试验 精密吸取“2.1.2”项下的供试品溶液20μL，分别于0、2、4、6、8h进样，测定芥子碱硫氰酸盐各时间点的峰面积。结果，峰面积平均值为3541.9，RSD=1.39%，表明供试品溶液在8h内稳定。图谱见图3。

2.2 正交设计筛选药材的提取工艺

2.2.1 因素与水平的设计 以白芥子中主要成分芥子碱硫氰酸盐的含量及提取物浸膏得率为考察指标，筛选白芥子、乳香2药合并乙醇提取的最佳工艺条件。选取影响较大的3个因素乙醇浓度（A）、溶剂用量（B）、提取时间（C），按照正交设计表L9（34）进行考察，每个因素设计3个水平，提取次数为1次，因素水平安排见表1。

表1 因素水平表

2.2.2 供试品溶液的制备 精密称取白芥子、乳香药材粗粉，按表2设定的因素水平，“2.1.2”项下供试品溶液制备方法制备。

2.2.3 芥子碱硫氰酸盐含量的测定 吸取上述定容液，按“2.1.1”项色谱条件进样分析，测得峰面积积分值，代入回归方程，计算芥子碱硫酸盐含量，结果见表2，方差分析见表3、4。由表2得出：影响香白通络巴布膏药材提取物得率的3个因素中，提取溶剂用量（因素B）的极差值最大，说明溶剂用量的影响最大，其次是提取时间（因素C）和乙醇浓度（因素A）。考虑到巴布剂对载药量有限，提取物浸膏得率低有利于巴布剂成型，所以最佳提取条件是A1B1C1。影响芥子碱硫氰酸盐提取量的3个因素中，乙醇浓度（因素A）的极差值最大，说明乙醇浓度的影响最大，其次是溶剂用量（因素B）和提取时间（因素C）。所以最佳提取条件是A2B2C3。由表3、4可知：乙醇浓度、溶剂用量、提取时间3个因素对提取物浸膏得率及芥子碱硫氰酸盐提取量的影响均无显著性差异。

表2 正交试验方案与结果

表3 提取物浸膏得率方差分析结果

表4 芥子碱硫氰酸盐测定数据方差分析结果

2.2.4 验证试验 为了确定提取条件，并考察A1B1C1、A2B2C32种提取工艺的稳定性，精密称取白芥子、乳香药材粗粉各10g，按上述2种工艺条件乙醇回流提取，平行试验3份。按上述浸膏的制备及供试液的制备与测定方式进行测定、计算，结果见表5。验证试验结果表明，2种提取工艺条件均较为稳定。A2B2C3条件下提取物中芥子碱硫氰酸盐的含量较高，该工艺条件相较于A1B1C1条件下的提取物浸膏得率略高。由于君药的主要成分芥子碱硫氰酸盐是药物疗效发挥的主要影响因素，而提取物浸膏得率仅对巴布剂成型工艺产生影响，因此，为了提高药物疗效，选择A2B2C3为最佳提取工艺条件，即乙醇浓度为60%，溶剂用量为8倍量，提取时间为1h。

表5 验证试验结果

3 讨论

3.1 2010年版《中国药典》一部“芥子”项下所列芥子碱硫氰酸盐的HPLC含量测定方法已由“苯基色谱柱、乙腈-3%醋酸梯度洗脱流动相系统”改为“C18色谱柱、乙腈-0.08mol/L磷酸二氢钾溶液流动相系统”。本实验对流动相中乙腈、磷酸二氢钾的比例进行考察，确定流动相为乙腈∶0.08mol/L磷酸二氢钾溶液=30∶70，系统适应性试验表明该分析方法快速、精确。

3.2 经正交筛选得到最佳提取工艺为：将药材粗粉加入药材量8倍的60%乙醇，浸渍0.5h，热回流1h。药材应提前粉碎成粗粉，药材不经粉碎不利于有效成分溶出，粉碎过细，提取液过于黏稠，过滤困难。优化后的提取工艺溶剂用量适中，提取时间较短，可节约制剂生产成本。

3.3 正交试验表明，提取时间虽然不是影响提取物得率的主要影响因素，但是随着提取时间的延长，提取物得率出现先升后降的趋势，推测可能是由于药材中挥发性成分较多，随提取时间延长而损失，所以提取时间不宜过长。本实验仅对处方中君药白芥子所含的芥子碱硫氰酸盐进行检测，建议对提取物中挥发性成分进行含量测定，进一步控制制剂质量。

［1］李小莉，张迎庆，黄通华.白芥子提取物的抗炎镇痛作用研究.现代中药研究与实践，2007，21（6）：28-30.

［2］郑杭生，冯年平，陈佳，等.乳香没药的提取工艺及其提取物的镇痛作用.中成药，2004，26（11）：956-958.

［3］杜松云，李其兰，余军，等.RP-HPLC法测定白芥子中芥子碱硫氰酸盐的含量.中国药房，2007，18（27）：2126-2128.

（2011 -01 -05 收稿）