大孔吸附树脂分离纯化胡黄连中胡黄连苷Ⅱ的工艺研究

2011-06-07 05:56李雪春杨晓宁李善茂
世界中医药 2011年2期
关键词:洗液大孔药液

李雪春杨晓宁李善茂

(1防化指挥工程学院,北京市昌平区阳坊,102205;2中国医药研究开发中心有限公司;3亚宝药业集团股份有限公司)

大孔吸附树脂分离纯化胡黄连中胡黄连苷Ⅱ的工艺研究

李雪春1,2杨晓宁3李善茂1

(1防化指挥工程学院,北京市昌平区阳坊,102205;2中国医药研究开发中心有限公司;3亚宝药业集团股份有限公司)

胡黄连;大孔吸附树脂分离纯化

胡黄连为玄参科植物胡黄连(Picrorhiza scrophulariiflora Pennell)的干燥根茎,是一味传统中药,具有清热凉血、燥湿消疳的作用,用于小儿惊痫、疳积、泻痢、骨蒸劳热、自汗、盗汗、吐血、目疾、痔瘘、疮肿等。近年来国内外研究发现,胡黄连中环烯醚萜苷类成分具有抗乙型肝炎病毒及保肝、降酶等多种药理活性[1]。本实验旨在优选出一种适合分离胡黄连苷Ⅱ的大孔树脂,并对优选出的大孔树脂分离胡黄连苷Ⅱ的工艺条件及参数进行研究,筛选出工艺简单、方法可靠的分离纯化工艺。

1 仪器与试剂

HP1100高效液相色谱仪(美国安捷伦公司);胡黄连苷Ⅱ对照品(中国药品生物制品检定所,批号:111596-200301);胡黄连药材(云南药材公司);D101、D201、AB-8和NKA-9大孔吸附树脂(南开大学化工厂);DB301大孔吸附树脂(天津欧瑞生物科技有限公司)

2 方法与结果

2.2 胡黄连提取液的制备 称取胡黄连药材粗粉1000g,每次加入70%乙醇8L热回流提取1h,提取3次。提取液滤过、合并,减压回收乙醇后,按需要加水稀释至一定体积。

2.3 大孔树脂的预处理 将大孔树脂用95%的乙醇浸泡12h,湿法装柱,用95%的乙醇液洗脱2倍柱体积(BV),然后用水洗净乙醇,加2%的盐酸溶液浸泡、洗脱,水洗至pH值中性,加2%氢氧化钠溶液浸泡、洗脱,水洗至pH值中性,最后用95%的乙醇液洗至流出液加等量水无白色浑浊现象,再用水洗净乙醇备用。

2.4 树脂型号的筛选 取净化好的型号为NKA-9、AB-8、D201、DB301、D101型大孔吸附树脂各10g,湿法装柱。吸取相同已知胡黄连苷Ⅱ浓度的提取液各50mL,以相同流速通过树脂柱,并分别用20mL(约合1个柱体积)的水洗脱,合并相应的流出药液和水洗液,混匀,定容,备用。再分别用70%的乙醇各150mL洗脱,收集洗脱液,定容,备用。分别测定胡黄连提取液、各树脂柱流出液-水洗液样品和70%乙醇洗脱液样品中胡黄连苷Ⅱ的量,计算不同型号树脂的吸附容量和洗脱率,结果见表1。

表1 树脂型号筛选结果(n=2)

由以上结果可以看出,以D101大孔树脂的吸附容量最大,为其他树脂型号的1.4~2.8倍,且70%乙醇洗脱率可以达到97%,洗脱效果较好,故选用D101大孔树脂。

2.5 洗脱剂的考察 取净化好的D101大孔树脂约100g,装柱,通过相同已知胡黄连苷Ⅱ浓度的胡黄连提取液100mL,并水洗至无色,收集水洗液,混匀,备用。继续分别用10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%的乙醇分别洗至无色,收集各乙醇浓度的洗脱液,混匀,备用。分别测定以上洗脱液中胡黄连苷Ⅱ的含量和固形物量,结果见表2。

表2 洗脱剂筛选结果(n=2)

由以上结果可以看出,胡黄连苷Ⅱ主要集中在30%乙醇的洗脱液中,占总洗脱量的87.3%,胡黄连苷Ⅱ的纯度为52.2%。若采用40%的乙醇洗脱,洗脱率虽然高,但胡黄连苷Ⅱ纯度下降到43.2%,直接影响到后续纯化结晶的收率。因此,选用30%的乙醇为洗脱剂,并采取先水洗,20%的乙醇洗,然后30%乙醇洗脱,收集30%洗脱液。

2.6 上柱药液浓度考察 取净化好的等量D101大孔树脂装柱,分别以相同流速通过稀释的不同浓度的胡黄连提取液。提取液中药材(g)与体积(mL)比例分别为1∶1、1∶2、1∶3、1∶4(药材/g∶体积/mL)。上样后分别用20mL的水洗脱,合并相应的流出药液和水洗液,测定其中胡黄连苷Ⅱ的含量,计算树脂的吸附容量,结果见表3。

表3 上柱药液浓度对吸附性能的影响(n=2)

以上结果可以看出,药液浓度对树脂吸附容量的影响不是很大,从数据直观分析,选用药液比例浓度为1∶2的药液,即选用药材浓度为0.5g·mL-1的药液上样。

[1]杜维明:《儒家传统与文明对话》,彭国翔编译,石家庄:河北人民出版社,2006年,第4、226页。

2.7 吸附流速的考察 取净化好的等量D101大孔树脂分别装柱备用。取相同已知胡黄连苷Ⅱ浓度的药液(药材与体积比为1∶2)分别以BV·h-1、2BV· h-1、3BV·h-1、4BV·h-1、5BV·h-1的流速通过树脂,并分别用20mL的水洗脱,合并相应的流出药液和水洗液,测定其中胡黄连苷Ⅱ的含量,计算树脂的吸附容量,结果见表4。

表4 吸附流速考察结果(n=2)

以上结果可以看出,上柱药液流速对树脂吸附影响较为明显,从数据结果来看,上柱的最佳流速为3BV ·h-1。

2.8 柱径比的考察 取不同直径的树脂柱,分别装入净化好的D101大孔树脂,树脂柱的柱径比分别为3∶1、5∶1、7∶1、9∶1、11∶1、13∶1,以相同流速通过相同已知胡黄连苷Ⅱ浓度的药液(药材与体积比为1∶2),并以4倍树脂体积的水洗至洗脱液无色,合并相应的流出液和水洗液,测定其中胡黄连苷Ⅱ的量,计算树脂的吸附容量,结果见表5。

表5 柱径比考察结果(n=2)

由以上结果可以看出,柱径比例越大,树脂相应的吸附容量越高,从上述数据结果结合生产实际考虑,柱径比例为7∶1时较为合适。

表6 药材与树脂比例考察结果(n=2)

2.9 药材与树脂比例考察 取净化好的等量的D101大孔树脂分别装柱,以相同流速分别通过相同已知胡黄连苷Ⅱ浓度的药液(药材与体积比为1∶2),通过树脂柱药液含胡黄连药材和树脂的比例分别为1∶2、1∶4、1∶6、1∶8,继续用同体积的水洗至流出液无色,合并相应的流出液和水洗液,测定其中胡黄连苷Ⅱ的量,结果见表6。

由以上结果可以看出,当药材和树脂比例达到1∶4时,胡黄连苷Ⅱ的泄漏量不足1.5%。当药材和树脂比例达到1∶6时,在上柱流出液和水洗液中检不出胡黄连苷Ⅱ。考虑到实际操作过程和试验之间存在的差异和树脂柱的反复使用,为安全起见,药材和树脂的比例选用1∶6。

2.10 洗脱流速 屠鹏飞等[2]建议洗脱流速采用全流速。而且在用30%乙醇洗脱时,全流速不足水洗脱全流速的20%,因此洗脱流速不作考察,采用全流速。

2.11 收集洗脱液量的考察 取已知吸附胡黄连苷Ⅱ量的大孔树脂柱(经20%乙醇洗脱后,树脂体积约为60mL),用30%乙醇洗脱,每洗脱120mL收集1个样品,测定样品中胡黄连苷Ⅱ的含量,计算洗脱率,结果显示,当洗脱液收集到树脂体积的6倍量时,洗脱率已经可以达到94%,继续洗脱收效甚微,浪费工时,因此收集洗脱液的量为树脂的6倍体积即可。

2.12 放大试验 取净品级的D101大孔树脂18Kg,装柱(Ф=18cm),柱径比为7∶1,用乙醇洗脱至洗液与水1∶4混合,不产生浑浊,继续用水洗至洗液不含醇,备用。

取3Kg胡黄连药材的提取液6L(胡黄连苷Ⅱ的浓度为46.7mg/mL)。将药液以3BV·h-1的流速通过大孔树脂柱,并分别以水和20%乙醇洗脱至洗脱液近无色,分别收集,备用。以30%乙醇洗脱,收集30%乙醇洗脱液200L(约计6倍树脂体积),减压浓缩至小体积备用。

分别测定水洗液、20%乙醇洗脱液和30%乙醇洗脱液中胡黄连苷Ⅱ的量,计算洗脱率。取30%乙醇洗脱浓缩液适量,测定固形物,计算胡黄连苷Ⅱ纯度。结果见表7。

表7 放大试验结果

由以上结果可以看出,总洗脱率达到91.8%,其中30%乙醇洗脱液中胡黄连苷Ⅱ的量占上样总量的85.5%,因在药液的浓缩过程中胡黄连苷Ⅱ也会有小部分的损失,因此认为洗脱过程较为完全,此树脂分离纯化工艺可行。

3 讨论

本试验以吸附容量和洗脱为指标,采用动态吸附法对大孔吸附树脂分离纯化胡黄连苷Ⅱ的工艺进行了系统地筛选考察,最终确定的工艺为:取净化好的D101大孔吸附树脂装柱,柱径比为7∶1,上柱药液浓度为1∶2(药材/g∶体积/mL),上样量与树脂的比例为1∶6(药材量/g∶树脂量/g),以3BV·h-1的流速通过大孔树脂柱,分别用水、20%的乙醇洗脱至流出液近无色,再用30%乙醇洗脱,收集6倍树脂体积的30%乙醇洗脱液即可。

[1]黄林清,张恩娟,王军,等.胡黄连的研究进展.《中国药业》,2007,16(7):1-2.

[2]屠鹏飞,贾存琴,张洪全,等.大孔吸附树脂在中药新药研究和生产中的应用.《世界科学技术》,2004,6(3):22-28.

(2011 -01 -21 收稿)

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