大孔吸附树脂分离纯化胡黄连中胡黄连苷Ⅱ的工艺研究

李雪春杨晓宁李善茂

（1防化指挥工程学院，北京市昌平区阳坊，102205；2中国医药研究开发中心有限公司；3亚宝药业集团股份有限公司）

大孔吸附树脂分离纯化胡黄连中胡黄连苷Ⅱ的工艺研究

李雪春1，2杨晓宁3李善茂1

（1防化指挥工程学院，北京市昌平区阳坊，102205；2中国医药研究开发中心有限公司；3亚宝药业集团股份有限公司）

胡黄连；大孔吸附树脂分离纯化

胡黄连为玄参科植物胡黄连（Picrorhiza scrophulariiflora Pennell）的干燥根茎，是一味传统中药，具有清热凉血、燥湿消疳的作用，用于小儿惊痫、疳积、泻痢、骨蒸劳热、自汗、盗汗、吐血、目疾、痔瘘、疮肿等。近年来国内外研究发现，胡黄连中环烯醚萜苷类成分具有抗乙型肝炎病毒及保肝、降酶等多种药理活性［1］。本实验旨在优选出一种适合分离胡黄连苷Ⅱ的大孔树脂，并对优选出的大孔树脂分离胡黄连苷Ⅱ的工艺条件及参数进行研究，筛选出工艺简单、方法可靠的分离纯化工艺。

1 仪器与试剂

HP1100高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；胡黄连苷Ⅱ对照品（中国药品生物制品检定所，批号：111596-200301）；胡黄连药材（云南药材公司）；D101、D201、AB-8和NKA-9大孔吸附树脂（南开大学化工厂）；DB301大孔吸附树脂（天津欧瑞生物科技有限公司）

2 方法与结果

2.2 胡黄连提取液的制备 称取胡黄连药材粗粉1000g，每次加入70%乙醇8L热回流提取1h，提取3次。提取液滤过、合并，减压回收乙醇后，按需要加水稀释至一定体积。

2.3 大孔树脂的预处理 将大孔树脂用95%的乙醇浸泡12h，湿法装柱，用95%的乙醇液洗脱2倍柱体积（BV），然后用水洗净乙醇，加2%的盐酸溶液浸泡、洗脱，水洗至pH值中性，加2%氢氧化钠溶液浸泡、洗脱，水洗至pH值中性，最后用95%的乙醇液洗至流出液加等量水无白色浑浊现象，再用水洗净乙醇备用。

2.4 树脂型号的筛选 取净化好的型号为NKA-9、AB-8、D201、DB301、D101型大孔吸附树脂各10g，湿法装柱。吸取相同已知胡黄连苷Ⅱ浓度的提取液各50mL，以相同流速通过树脂柱，并分别用20mL（约合1个柱体积）的水洗脱，合并相应的流出药液和水洗液，混匀，定容，备用。再分别用70%的乙醇各150mL洗脱，收集洗脱液，定容，备用。分别测定胡黄连提取液、各树脂柱流出液-水洗液样品和70%乙醇洗脱液样品中胡黄连苷Ⅱ的量，计算不同型号树脂的吸附容量和洗脱率，结果见表1。

表1 树脂型号筛选结果（n=2）

由以上结果可以看出，以D101大孔树脂的吸附容量最大，为其他树脂型号的1.4～2.8倍，且70%乙醇洗脱率可以达到97%，洗脱效果较好，故选用D101大孔树脂。

2.5 洗脱剂的考察 取净化好的D101大孔树脂约100g，装柱，通过相同已知胡黄连苷Ⅱ浓度的胡黄连提取液100mL，并水洗至无色，收集水洗液，混匀，备用。继续分别用10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%的乙醇分别洗至无色，收集各乙醇浓度的洗脱液，混匀，备用。分别测定以上洗脱液中胡黄连苷Ⅱ的含量和固形物量，结果见表2。

表2 洗脱剂筛选结果（n=2）

由以上结果可以看出，胡黄连苷Ⅱ主要集中在30%乙醇的洗脱液中，占总洗脱量的87.3%，胡黄连苷Ⅱ的纯度为52.2%。若采用40%的乙醇洗脱，洗脱率虽然高，但胡黄连苷Ⅱ纯度下降到43.2%，直接影响到后续纯化结晶的收率。因此，选用30%的乙醇为洗脱剂，并采取先水洗，20%的乙醇洗，然后30%乙醇洗脱，收集30%洗脱液。

2.6 上柱药液浓度考察 取净化好的等量D101大孔树脂装柱，分别以相同流速通过稀释的不同浓度的胡黄连提取液。提取液中药材（g）与体积（mL）比例分别为1∶1、1∶2、1∶3、1∶4（药材/g∶体积/mL）。上样后分别用20mL的水洗脱，合并相应的流出药液和水洗液，测定其中胡黄连苷Ⅱ的含量，计算树脂的吸附容量，结果见表3。

表3 上柱药液浓度对吸附性能的影响（n=2）

以上结果可以看出，药液浓度对树脂吸附容量的影响不是很大，从数据直观分析，选用药液比例浓度为1∶2的药液，即选用药材浓度为0.5g·mL-1的药液上样。

[1]杜维明：《儒家传统与文明对话》，彭国翔编译，石家庄：河北人民出版社，2006年，第4、226页。

2.7 吸附流速的考察 取净化好的等量D101大孔树脂分别装柱备用。取相同已知胡黄连苷Ⅱ浓度的药液（药材与体积比为1∶2）分别以BV·h-1、2BV· h-1、3BV·h-1、4BV·h-1、5BV·h-1的流速通过树脂，并分别用20mL的水洗脱，合并相应的流出药液和水洗液，测定其中胡黄连苷Ⅱ的含量，计算树脂的吸附容量，结果见表4。

表4 吸附流速考察结果（n=2）

以上结果可以看出，上柱药液流速对树脂吸附影响较为明显，从数据结果来看，上柱的最佳流速为3BV ·h-1。

2.8 柱径比的考察 取不同直径的树脂柱，分别装入净化好的D101大孔树脂，树脂柱的柱径比分别为3∶1、5∶1、7∶1、9∶1、11∶1、13∶1，以相同流速通过相同已知胡黄连苷Ⅱ浓度的药液（药材与体积比为1∶2），并以4倍树脂体积的水洗至洗脱液无色，合并相应的流出液和水洗液，测定其中胡黄连苷Ⅱ的量，计算树脂的吸附容量，结果见表5。

表5 柱径比考察结果（n=2）

由以上结果可以看出，柱径比例越大，树脂相应的吸附容量越高，从上述数据结果结合生产实际考虑，柱径比例为7∶1时较为合适。

表6 药材与树脂比例考察结果（n=2）

2.9 药材与树脂比例考察 取净化好的等量的D101大孔树脂分别装柱，以相同流速分别通过相同已知胡黄连苷Ⅱ浓度的药液（药材与体积比为1∶2），通过树脂柱药液含胡黄连药材和树脂的比例分别为1∶2、1∶4、1∶6、1∶8，继续用同体积的水洗至流出液无色，合并相应的流出液和水洗液，测定其中胡黄连苷Ⅱ的量，结果见表6。

由以上结果可以看出，当药材和树脂比例达到1∶4时，胡黄连苷Ⅱ的泄漏量不足1.5%。当药材和树脂比例达到1∶6时，在上柱流出液和水洗液中检不出胡黄连苷Ⅱ。考虑到实际操作过程和试验之间存在的差异和树脂柱的反复使用，为安全起见，药材和树脂的比例选用1∶6。

2.10 洗脱流速 屠鹏飞等［2］建议洗脱流速采用全流速。而且在用30%乙醇洗脱时，全流速不足水洗脱全流速的20%，因此洗脱流速不作考察，采用全流速。

2.11 收集洗脱液量的考察 取已知吸附胡黄连苷Ⅱ量的大孔树脂柱（经20%乙醇洗脱后，树脂体积约为60mL），用30%乙醇洗脱，每洗脱120mL收集1个样品，测定样品中胡黄连苷Ⅱ的含量，计算洗脱率，结果显示，当洗脱液收集到树脂体积的6倍量时，洗脱率已经可以达到94%，继续洗脱收效甚微，浪费工时，因此收集洗脱液的量为树脂的6倍体积即可。

2.12 放大试验 取净品级的D101大孔树脂18Kg，装柱（Ф=18cm），柱径比为7∶1，用乙醇洗脱至洗液与水1∶4混合，不产生浑浊，继续用水洗至洗液不含醇，备用。

取3Kg胡黄连药材的提取液6L（胡黄连苷Ⅱ的浓度为46.7mg/mL）。将药液以3BV·h-1的流速通过大孔树脂柱，并分别以水和20%乙醇洗脱至洗脱液近无色，分别收集，备用。以30%乙醇洗脱，收集30%乙醇洗脱液200L（约计6倍树脂体积），减压浓缩至小体积备用。

分别测定水洗液、20%乙醇洗脱液和30%乙醇洗脱液中胡黄连苷Ⅱ的量，计算洗脱率。取30%乙醇洗脱浓缩液适量，测定固形物，计算胡黄连苷Ⅱ纯度。结果见表7。

表7 放大试验结果

由以上结果可以看出，总洗脱率达到91.8%，其中30%乙醇洗脱液中胡黄连苷Ⅱ的量占上样总量的85.5%，因在药液的浓缩过程中胡黄连苷Ⅱ也会有小部分的损失，因此认为洗脱过程较为完全，此树脂分离纯化工艺可行。

3 讨论

本试验以吸附容量和洗脱为指标，采用动态吸附法对大孔吸附树脂分离纯化胡黄连苷Ⅱ的工艺进行了系统地筛选考察，最终确定的工艺为：取净化好的D101大孔吸附树脂装柱，柱径比为7∶1，上柱药液浓度为1∶2（药材/g∶体积/mL），上样量与树脂的比例为1∶6（药材量/g∶树脂量/g），以3BV·h-1的流速通过大孔树脂柱，分别用水、20%的乙醇洗脱至流出液近无色，再用30%乙醇洗脱，收集6倍树脂体积的30%乙醇洗脱液即可。

［1］黄林清，张恩娟，王军，等.胡黄连的研究进展.《中国药业》，2007，16（7）：1-2.

［2］屠鹏飞，贾存琴，张洪全，等.大孔吸附树脂在中药新药研究和生产中的应用.《世界科学技术》，2004，6（3）：22-28.

（2011 -01 -21 收稿）