三聚氰胺分子印迹聚合物的制备及固相萃取条件优化比较

齐娜,陈娜,陈军,田园,张裕平

（1.河南科技学院,河南新乡453003；2.河南工业大学,河南郑州450052）

三聚氰胺是一种三嗪类含氮杂环有机化合物,重要的氮杂环有机化工原料.最主要的用途是作为生产三聚氰胺甲醛树脂的原料.由于采用估测食品和饲料工业蛋白质含量方法的缺陷,三聚氰胺常被不法商人掺进食品或饲料中,以提升食品或饲料检测中的蛋白质含量指标,因此三聚氰胺也被作假的人称为“蛋白精”.近年来发生的国内婴儿奶粉受三聚氰胺污染导致婴儿肾结石事件以及美国的数起饲料致死宠物的事件,使三聚氰胺的检测成为关注热点.目前对于三聚氰胺的检测方法有很多,诸如毛细管电泳[1-2]、气相色谱-质谱法[3-4]、微流毛细管液相色谱法[5]等.这些方法都很繁琐,仪器复杂.在此背景下,新的检测技术或样品预处理方法被积极开发出来,分子印迹技术就是其中的一项技术.

分子印迹技术是制备具有分子识别能力聚合物的技术[6-8].分子印迹聚合物（molecularimprintingpolymers,MIP）是将模板分子与交联剂在聚合物单体溶液中进行聚合得到固体介质,然后通过物理或化学方法洗脱除去介质中的模板分子,得到“印迹”有目标分子空间结构和结合位点的高分子聚合物[9].本文先用模板分子（三聚氰胺）与功能单体（MAA）通过共价键或非共价键结合,制备出配合物,然后和交联剂EDMA反应生成高聚物,最后将模板分子从聚合物中除去,制得三聚氰胺分子印迹聚合物,再将制得的印迹聚合物制备成固相萃取柱,优化上样、淋洗、洗脱等固相萃取步骤,筛选出三聚氰胺分子印迹固相萃取柱的最佳固相萃取条件.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

甲基丙烯酸、辛烷磺酸钠、乙二醇二甲基丙烯酸酯购自百灵威公司；光引发剂Irgacure 1800购自Ciba公司；三聚氰胺购自天津市博迪化工有限公司；偶氮二异丁腈、柠檬酸、氢氧化钠、甲苯、异辛烷、十二烷基磺酸钠、甲醇、冰乙酸、氨水均为分析纯,购自天津市风船化学试剂科技有限公司；实验用水均为二次蒸馏水；乙腈、甲醇均为色谱纯,购自天津市福晨化学试剂厂.

Agilent1100型高效液相色谱仪（Agilent Technologies,USA）；固相萃取装置、氮吹仪（美国Supelco公司）；UV-2100双光束紫外-可见分光光度计（北京瑞利分析仪器有限公司）；GM-0.5A型隔膜真空泵（天津市津腾实验设备有限公司）；HH-4数显恒温水浴锅（河南智诚科技发展有限公司）.

1.2 三聚氰胺分子印迹聚合物的制备

将0.15 g三聚氰胺与0.4 mLMAA溶解于玻璃瓶中,再加入交联剂EDMA 3.76 mL,超声5 min后,加入6.5 mL甲苯和1.5 mL异辛烷,超声混匀,50℃下搅拌该混合物至均匀,热聚合加入0.04 g热引发剂AIBN（光聚合加入0.04 g光引发剂Irgacure 1800）,搅拌至溶液均匀,充氮气5 min,除去溶解氧,密封,在65℃恒温水浴中聚合24 h,得到白色块状聚合物（反应原理见图1）.

图1 三聚氰胺分子印迹聚合物的聚合反应原理

聚合物研磨,过200～400目的筛（保留47～74 μm的颗粒）,之后用甲醇-乙酸（体积比 9∶1）洗去模板分子,洗脱液至紫外检测不到三聚氰胺为止,再用甲醇洗去乙酸至溶液呈中性,用甲醇反复沉降2～3次,除去颗粒极小的悬浮粉末,得到三聚氰胺分子印迹聚合物,室温真空干燥至恒重.空白聚合物除不加三聚氰胺目标物外,其余与印迹聚合物的制备方法相同.光聚合分子印迹聚合物和空白聚合物的制备与热引发聚合物的制备,仅仅只是引发剂不同,其他条件均相同.

1.3 三聚氰胺分子印迹固相萃取柱的制备

称取20 mg助滤剂以及粒径为47～74 μm的热（光）引发聚合的三聚氰胺分子印迹聚合物和空白聚合物各60 mg,到3 mL带有滤板的SPE空管柱中,制成三聚氰胺MI-SPE.考察不同的上样、淋洗和洗脱条件下MI-SPE柱对三聚氰胺的保留能力.三聚氰胺的上样浓度为10.0 mg/L,上样5 mL,收集洗脱液,N2吹后,用流动相（离子对/乙腈=84/16（V/V））定容到5 mL,用HPLC测定.同时用空白聚合物制备非印迹固相萃取柱作对照实验.

1.4 高效液相色谱测定三聚氰胺的色谱条件

用 YMCC18色谱柱（150 mm×4.6 mm,4 μm）,流动相为离子对 /乙腈（V/V=84/16）（离子对配制：准确称取2.10 g柠檬酸和2.16 g辛烷磺酸钠,加入950 mL水溶解,调节pH=3.0后,定容到1 L）,柱温为20℃,流速为1.0 mL/min,进样量为20 μL,检测波长为220 nm.

2 结果与讨论

2.1 三聚氰胺分子印迹聚合物模版的去除

聚合完成后需将印迹孔穴中的模板分子从聚合物中洗脱出来.模板分子的洗脱对于后面测量分子印迹聚合物的吸附能力、选择性及固相萃取至关重要.对于非共价型MIPs,模板与聚合物母体间靠较弱的氢键或离子作用等非共价键结合,一般采用乙腈、水、甲醇-乙酸（或三氟乙酸）、乙腈-乙酸等高极性溶剂反复洗涤即可除去模板分子,而最常用的方法是传统的索氏提取法,此法不但费时,而且消耗试剂量比较大.

本实验室采用超声、离心和高压冲洗相结合的方式来洗脱模板分子.此方法能节省试剂、缩短洗涤时间、减低聚合物损失、保证彻底洗脱干净.

超声波+离心机洗脱法是取适量聚合物加定量的洗脱液（甲醇/乙酸=9/1,V/V）,在超声波清洗器上超声10 min,随后用离心机以4 000 r/min离心10 min至上清液澄清,除去洗脱液,吸取适量上清液用紫外-可见光度法在适当波长下（200～240 nm）进行测定.照此步骤反复洗3～5次,直至洗脱液中检测不到模板分子（当吸光度达到小数点后1位为零时）,可认为基本上洗脱干净,最后按上述方法用甲醇洗脱3～5次,以除去过量的乙酸.

高压冲洗,则是取适量聚合物,装进不锈钢管柱,再将钢管柱放到高压泵上,用甲醇/乙酸（9/1,V/V）冲洗聚合物,连续冲洗30 min后,再将柱子换方向冲洗30 min,吸取适量上清液用紫外-可见光度法在适当波长下（200～240 nm）进行测定.反复冲洗几次,直到洗脱液体中检测不出模板分子,之后用甲醇冲洗,以除去过量乙酸.

2.2 三聚氰胺分子印迹固相萃取柱萃取条件的优化

分别制备出三聚氰胺MI-SPE热和MI-SPE光后,进行固相萃取条件的优化（见表1）,选择出最佳固相萃取条件,以便能更好的检测三聚氰胺.

表1 三聚氰胺分子印迹聚合物固相萃取条件优化

（续表）

结果表明,用甲醇淋洗MI-SPE和NI-SPE,回收率的损失都大于用甲苯淋洗,但是用甲苯淋洗,除去杂质的能力较低,所以选用3 mL甲苯、3 mL甲醇、3 mL水依次进行淋洗.分别用5 mL不同比例的氨化甲醇溶液（3%,5%,8%,10%,12%,V/V）做洗脱液.随着氨水比例的增加,回收率也依次增加,氮吹的时间也随着增加.选用5 mL体积分数为8%的氨化甲醇作为洗脱液时,氮吹的时间适中,且MI-SPE热和MI-SPE光的回收率均在90%以上.

2.3 三聚氰胺液相色谱条件的选择

2.3.1 检测波长的选择 在不同波长下对三聚氰胺进行液相色谱检测,发现三聚氰胺在200～240 nm范围有较大吸收.但在240 nm和230 nm处的出峰时间太慢,而在220 nm处,出峰快且峰形好（如图2）.最终选择220 nm作为三聚氰胺液相分析的波长.

2.3.2 流动相的选择 常用做反相流动相的溶剂是甲醇和乙腈,但是甲醇活性高,可能与某些样品发生反应,而且甲醇在低波长下有紫外吸收,会降低分析方法的灵敏度；乙腈洗脱能力比甲醇强,很少与样品发生反应,用作流动相系统压力要比甲醇低很多,所以这里我们选择用乙腈.

对流动相的优化主要在水相上下功夫,水里可以加酸、加碱、加盐,从而改善峰形、提高分离度.流动相里加碱的情况比较少,主要还是加酸,在单独用酸不行的时候就要使用缓冲盐,用缓冲盐做流动相时,出峰太早、峰形很差、结构相似化合物的峰,因为拖尾或峰型太宽而不能达到基线分离时,要使用离子对试剂.

乙腈和离子对的比例调节至关重要,乙腈含量少时,出峰时间特别慢；离子对含量少时,虽然出峰时间较短,但峰形很差,甚至分离不开.实验最终选择离子对/乙腈=84/16作为流动相（见图3）.在此条件下的色谱图,出峰快,分离效果好.

图2 不同检测波长下的三聚氰胺液相色谱

图3 不同流动相配比下的三聚氰胺液相色谱

2.3.3方法的线性范围和检出限 按试验方法分别对0.2,1,2,4,6,8,10,12 mg/L三聚氰胺系列标准溶液进行测定,结果表明：三聚氰胺质量浓度在0.2～112 mg/L范围内,浓度与峰面积呈线性关系.方法的检出限（3S/N）为0.1 mg/L.

2.3.4 三聚氰胺分子印迹固相萃取柱洗脱液的检测将5 mL、10.0 mg/L的三聚氰胺标准溶液,依照固相萃取过程分别通过三聚氰胺MI-SPE热和MI-SPE光后,收集洗脱液,按照1.4节的条件进行三聚氰胺的液相色谱检测,测得三聚氰胺MI-SPE热和MI-SPE光与空白柱洗脱液的色谱图见图4.

三聚氰胺MI-SPE对含有10.0 mg/L的三聚氰胺标准溶液进行富集,吸附能力较强,洗脱后分别计算MI-SPE热和MI-SPE光的回收率,并进行比较,结果见表2.

图4 三聚氰胺分子印迹固相萃取柱与空白柱洗脱液色谱

表2 三聚氰胺MI-SPE热和MI-SPE光回收试验

由图4和表2可看出,MI-SPE热和MI-SPE光对三聚氰胺均有较好印迹效果,且MI-SPE光的印迹效果又明显好于MI-SPE热的印迹效果.

3 结论

以三聚氰胺为模板分子,采用分子印迹技术分别合成三聚氰胺MIP光和MIP热,用这两种聚合物制备的固相萃取柱对三聚氰胺均呈现高的选择结合特性.洗脱液回收率试验表明,MI-SPE光的印迹效果高于MI-SPE热的印迹效果.

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