饲料磷水平对草鱼形体的影响及其骨骼畸形的判定

肖顺应 叶元土蔡春芳 金素雅 朱 磊 姚仕彬 姚林杰

(苏州大学基础医学与生物科学学院，江苏省水产动物营养重点实验室，苏州 215123)

饲料磷在鱼体形体上主要表现在对骨骼系统的影响，如出现骨骼钙化不全、骨骼形变以及脊椎侧弯、鳃盖残缺等现象。Uyan等［1］研究发现，在给牙鲆饲喂低磷饲料后，试验前期鳃盖及骨组织的微结构已经发生变化。Sugiura等［2］和Baeverfjord等［3］在试验中也观察到了磷缺乏导致的由鳃盖畸变到骨骼形变的过程。本试验拟在纯化饲料中添加不同浓度的磷酸二氢钙，旨在研究饲料磷水平对草鱼形体的影响，并对鱼体的骨骼畸形状况进行判定。

1 材料与方法

1.1 试验材料

草鱼(Ctenopharyngodon idellus)幼鱼由江苏省苏州市相城区特种水产养殖场提供，磷酸二氢钙由无锡华诺威动物保健品有限公司提供，酪蛋白、糊精、明胶、羧甲基纤维素钠、微晶纤维素、无水氯化钙购于国药集团化学试剂有限公司，玉米淀粉购于江苏省苏州市莲花五区农贸市场。

1.2 试验饲料

根据草鱼的配合饲料营养标准(SC/T 1024—1997)设计配方，在以酪蛋白、豆油、淀粉、糊精和纤维素为原料的纯化饲料中分别添加0、13、29、45、61、77 g/kg磷酸二氢钙，试验饲料组成及营养水平见表1。饲料原料经粉碎过60目筛，混合均匀，用小型面条加工机加工成1.5 mm粗细的条状料，电风扇条件下干燥后再手工搓碎，筛选3～4 mm长的颗粒饲料置于冰箱中4℃密封保存。

1.3 饲养管理

试验草鱼初始平均体重为22.29 g，为池塘养殖的1冬龄鱼种。试验鱼经1周暂养、驯化后，选择体格健壮、规格整齐的鱼种270尾，随机分为6个组，每组设3个重复，每个重复放鱼15尾，分别投喂饲料Ⅰ～Ⅵ。正式养殖试验持续75 d。

养殖设施为室内养殖系统，单缸直径70 cm，养殖容积0.23 m3，以曝气自来水为水源，使用间歇性控电开关调节水体，每进水20 min关闭40 min，反复循环，缸内出水直接排走。定期使用水博士水质测定盒测量水质。养殖期间水质条件为:水温20～26℃、溶解氧含量在6.0 mg/L以上、pH 7.0 ～7.4、氨氮含量 0.20 ～0.40 mg/L、亚硝酸盐氮含量0.05～0.10 mg/L。试验饲料于每天08:00、12:00、17:30各投喂1次，投喂量为各试验组鱼体体重的2%～3%。

表1 试验饲料组成及营养水平(干物质基础)Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets(DM basis) g/kg

1.4 样品采集与分析

养殖试验开始前，取10尾草鱼测定鱼体体重、体长、吻－鳃盖长。养殖试验结束时，从每个养殖缸中随机取8尾鱼测定鱼体体重、体长、吻－鳃盖长，计算体长特定生长率、吻－鳃盖长/体长(吻端至鳃盖末端长与体长的比值)以及肥满度;每组随机取鱼3尾用X光机进行鱼体骨骼的观察。

1.5 数据处理与分析

试验结果用SPSS 17.0软件进行统计分析，数据以平均值±标准差表示，采用Duncan氏多重比较检验组间差异，以P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 对草鱼体长特定生长率的影响

由表2可知，草鱼体长特定生长率最高的是Ⅲ组，达到 0.65%/d，显著高于Ⅰ、Ⅱ组(P ＜0.05);最低的是Ⅰ组，为0.34%/d，显著低于除Ⅱ组外的其他试验组(P＜0.05);其余各试验组间没有显著性差异(P＞0.05)。上述结果说明当饲料磷酸二氢钙水平低于29 g/kg时，体长特定生长率随饲料磷水平的增加而升高，当磷酸二氢钙水平高于45 g/kg时，体长特定生长率保持比较稳定的状态。

表2 各试验组草鱼的体长特定生长率、吻－鳃盖长/体长和肥满度Table 2 The specific growth rate of length，snout-gill cover length/body length and condition factor of grass carp in different experimental groups

2.2 对草鱼肥满度的影响

由表2可知，饲料磷水平对草鱼的肥满度没有显著影响(P＞0.05)，但以Ⅲ组的肥满度最高，为2.00%。这说明当饲料中磷酸二氢钙的水平为29 g/kg时，草鱼能获得较高的肥满度。

2.3 对吻－鳃盖长/体长的影响

由表2可知，各试验组草鱼的吻－鳃盖长/体长没有显著差异(P ＞0.05)，均在 0.26 ～0.28 范围内。这说明饲料磷水平对草鱼鳃盖骨的发育没有造成显著的影响，没有出现因磷的缺乏或者过量而导致的鳃盖骨畸形情况。

2.4 对草鱼畸形程度的影响

在养殖的过程中，试验鱼没有出现诸如出血等体表受伤的病状。养殖试验结束后，肉眼观察可发现部分鱼的骨骼出现了畸形，畸形的主要部位在鱼的尾柄。各试验组草鱼在X射线照射下的骨骼状况见图1。

由X射线照射结果可知，饲料中磷水平对6个试验组的草鱼头骨没有明显的影响，肉眼不能观察到头骨出现畸形的状况。饲料磷水平对草鱼脊椎骨有明显的影响，主要表现为引起了草鱼脊椎骨的变形，发生脊椎骨弯曲的部位约在脊椎骨末端1/5处。由X线片及采样时的观察可知:Ⅰ组草鱼的脊椎骨在肉眼和X射线下观察都没有发现明显的畸形情况(图1－Ⅰ);Ⅱ和Ⅲ组草鱼的脊椎骨在肉眼观察时基本没有发现明显的畸形情况，但是在X射线下观察时发现部分鱼的脊椎骨已经有了一定的畸形情况(图1－Ⅱ和图1－Ⅲ);Ⅳ组草鱼的脊椎骨在肉眼观察时可见部分鱼的尾部稍微有些上翘，在X射线下观察时发现部分鱼的脊椎骨已经有了一定的畸形情况(图1－Ⅳ);Ⅴ和Ⅵ组草鱼的脊椎骨在肉眼观察时就能发现一些草鱼尾部上翘，尤其是Ⅵ组草鱼尾部已经严重弯曲上翘，在X射线下观察时发现尾部脊椎骨也有了畸形的情况(图1－Ⅴ和图1－Ⅵ)。由此可以判断:Ⅰ组草鱼没有出现畸形或者畸形的程度不严重，肉眼还不能准确判断;Ⅱ和Ⅲ组草鱼已经开始出现轻微的畸形，因为畸形的程度不严重，所以只能在X射线条件下观察到脊椎骨的畸形而不能肉眼识别体形的不正常，畸形的程度只视为轻度畸形;Ⅳ组草鱼已经开始出现畸形，肉眼能识别出体形的不正常，在X射线条件下可观察到脊椎骨的畸形，畸形的程度可视为中度畸形;Ⅴ和Ⅵ组草鱼出现的畸形情况比较严重，不只是脊椎骨出现明显的畸形情况，就连鱼体的外表形态也发生明显的畸形变化，并可通过肉眼观察判断，可视为重度畸形。

3 讨论

鱼类在生长发育过程中，鱼体会发生一系列结构和功能上的变化。鱼类在发育的过程中容易出现骨骼的非健康状态，骨骼的发育畸形包括脊柱侧凸、脊柱前弯、鳃盖弯曲、尾椎畸形和颌畸形等，同时，出现畸形的鱼往往生长缓慢、抗病能力弱［4］。影响鱼类骨骼发育的因素主要有饲料中钙、磷、维生素及氨基酸含量以及脂肪的含量和种类等。Geurden 等［5－6］研究报道，不同类型的磷脂对鲤鱼的生长和发育有不同的影响，卵磷脂具有促生长的作用，而肌醇酸磷脂则能显著降低骨骼畸形。陈彦等［7］的研究表明，磷脂及其代谢产物能提高作为生物膜Ca2+转运系统重要组成部分的Ca2+-ATP酶的活性，Ca2+-ATP酶不仅参与骨组织有机质的钙化，还直接参与成骨细胞向骨组织的分化，是决定骨骼正常发育的重要因素。Gapasin等［8］研究报道，投喂添加高不饱和脂肪酸的饲料能显著降低比目鱼的鳃盖畸形率，其鳃盖畸形率由未添加时的27.3% ～33.5%降低到了添加后的15.8% ～23.5% 。Gapasin［9］报道，二十二碳六烯酸(DHA)和维生素C都能影响比目鱼骨骼的发育，投喂添加DHA的饲料后比目鱼的畸形率由33%降低到了17%，而投喂添加DHA和维生素C饲料后比目鱼的畸形率只有8.4% ～13.7%。Dedi等［10］报道，在日本比目鱼饲料中添加高剂量的维生素A后，比目鱼的生长速度降低，出现脊柱弯曲、椎骨缩短等骨骼畸形情况。Takeuchi等［11］在比目鱼饲料(车轮虫)中添加几种维生素A后，比目鱼出现了严重的骨骼畸形。Dabrowski［12］研究报道，鲤鱼饲料中缺乏维生素C时会出现脊柱侧凸、鳃丝扭曲、鳃盖变短等畸形的症状。Dabrowski等［13］研究表明，维生素C缺乏会引起鲤鱼幼苗鳃弓变形和尾鳍腐烂。Hilomen-Garcia［14］报道，当饲料中维生素C缺乏时，会影响比目鱼鳃盖的发育，从而导致比目鱼的鳃盖膜裂开。Akiyama等［15］报道，色氨酸缺乏将会引起红马哈鱼、虹鳟鱼、大马哈鱼和银大马哈鱼的脊柱侧凸，色氨酸能有效治愈大马哈鱼的骨骼畸形。

图1 各试验组草鱼的X线片Fig.1 X-ray film of grass carp in different experimental groups

在已有的文献中，研究的主要方向都是营养素对鱼类骨骼发育的影响，一系列营养素的缺乏或过量可能会引起骨骼系统的畸形，尤其是脊椎骨的畸形;而对于鱼体畸形的判定主要是通过肉眼的观察，看其与正常鱼体的形态特征是否有差别来加以判断。在本试验中出现了肉眼观察鱼体体形正常，但在X射线条件下观察鱼体脊椎骨已经出现了一定程度畸形的现象。因此，对鱼体畸形情况的判定标准对科研试验的进行具有很大的指导意义。本文把鱼类的骨骼畸形程度作以下的区别。

健康鱼体:通过肉眼观察鱼体体形正常，在X射线或其他方式条件下直接观察脊椎骨形态正常的鱼体为健康鱼体。

轻度畸形:通过肉眼观察鱼体体形正常，在X射线或其他方式条件下可直接观察到脊椎骨在某一点开始偏离脊椎骨主轴，但鱼体体形仍基本保持正常，与主轴之间形成一定的角度，当角度低于时20.0°时，认为该尾鱼为轻度畸形，如图2－A所示。

中度畸形:通过肉眼可观察到鱼体的尾柄已经出现了一定程度的畸形，在X射线或其他方式条件下可直接观察到脊椎骨在某一点开始偏离脊椎骨主轴，并与主轴之间形成一定的角度，角度大小在 20.0°～45.0°时，认为该尾鱼为中度畸形，如图2－B所示。

重度畸形:通过肉眼可观察到鱼体体形已经出现了严重的畸形，在X射线或其他方式条件下可直接观察到脊椎骨某点偏离主轴角度大于45.0°，或者出现不止一次的偏离主轴时，认为该尾鱼为重度畸形，如图2－C所示。

图2 草鱼骨骼畸形图示Fig.2 Graphical representation of grass carp bone deformity

在本试验中，Ⅰ组草鱼形体健康，没有发现畸形情况;Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组草鱼出现了轻度或者中度畸形的情况;Ⅴ和Ⅵ组草鱼出现了重度畸形情况。在形态学上，鱼类的骨骼包括头部膜骨、体内骨骼和鳞片。在本试验中，从形态学观察来看，养殖结束后鱼体的头骨、鳃盖骨及鳞片没有发现异常现象，但是饲料含磷量高的组出现了尾柄畸形的情况，从X射线下观察脊椎骨可知高磷组草鱼的畸形情况比较严重，而低磷组草鱼脊椎骨反而正常，这与众多研究中认为饲料中磷含量偏低会引起鱼体骨骼畸形的观点相悖。这可能是因为，在养殖过程中，低磷组草鱼的摄食率偏低，摄入的磷酸二氢钙含量低于高磷组草鱼，又由于纯化饲料的适口性较差，硬度较大，不利于鱼体对营养物质的吸收利用，从而阻碍了鱼体的生长，因此低磷组草鱼的生长性能不好，畸形情况没有体现出来，而高磷组草鱼摄入了过量的磷酸二氢钙，从而导致了鱼体的畸形。

4 结论

①本试验条件下，饲料中磷酸二氢钙添加过量(超过29 g/kg)时容易影响草鱼形体发育，导致鱼体骨骼的畸形。

②按鱼体的脊椎骨畸形情况可以把草鱼形体分为4个等级(健康鱼体、轻度畸形、中度畸形和重度畸形)，鱼体脊椎骨的畸形情况可作为饲料磷水平的一个判断标准。

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