应用改进ELISA检测干血棉球HIV抗体的可行性研究

赵红玉 李 颖

1.甘肃省灵台县疾病预防控制中心，甘肃灵台 744400；2.甘肃省平凉市第二人民医院，甘肃平凉 744000

目前我国HIV抗体筛查实验室都采用ELISA法检测血清样品中HIV抗体，而血清在常温下存放容易变质；虽然用滤纸干血斑样品便于储存和运输，但因样品载量小（每个滤纸片载体仅容纳50～100 μL血清），其应用范围受到限制。选择何种载体既具有较大的样品载量，以便进行多项目检测，又便于在常温下容易储存和运输；又用何种方法检测这种特殊载体的HIV抗体，这是本研究要探讨的两个问题。医用脱脂棉柔软膨松，吸水性极强，有容易获得，是血清样品的最佳载体。将血清滴于干棉球上制成干血棉球，具有较大的血清容量（每克棉球可吸纳约200～400 μL血清），储存和运输都比较方便，而且样品的前处理也非常容易。为研讨干血棉球代替血清样品检测HIV抗体的可行性，笔者用ELISA法对298份干血棉球与相同血清样品进行了实验对比。为弥补干血棉球处于较高温度、储存较长时间可能会引起HIV抗体阳性样品OD值降低，导致弱阳性出现假阴性结果，本实验又对检测干血棉球HIV抗体的ELISA法进行改进，以提高检测方法的灵敏度。

1 材料与方法

1.1 样品来源

HIV抗体阳性样品来自笔者所在县随访管理的艾滋病患者和HIV感染者及用HIV抗体阴性血清稀释HIV抗体阳性血清制成的弱阳性样品，共100份，其中S/CO比值在1～3的弱阳性样品20份；HIV抗体阴性样品为自愿咨询检测及公共场所从业人员，共198份。

1.1.1 血清样品制备 采集静脉血5 mL，室温放置2 h，自然凝固后3 000 r/min离心15 min分离血清，置-20 ℃保存使用。

1.1.2 干血棉球 器材:干棉球[2]，在具有圆形凹槽塑料膜一面，固定一个或几个适当大小的医用脱脂棉球作为血清样品的载体，在纸壳板的另一面可注明样品来源、检测目的、采血日期等项目。

制备：将血清样品200 μL滴于1个棉球载体上，每份血清可滴于一至数个棉球载体，37℃干燥过夜，干燥器干燥后后置密封袋中，即为干血棉球。37℃储存3周。

1.2 试剂

珠海丽珠试剂股份有限公司生产，ELISA法检测HIV-1/HIV-2抗体试剂，批号为2010100708。

1.3 仪器

美国产Stat Fax 2 100型全自动酶标分析仪，美国产Stat Fax 2 600型洗板机。

1.4 方法

1.4.1 按试剂盒说明书操作 采用450/630 nm双波长，不设空白对照。用美国产Stat Fax 2 100型全自动酶标分析仪比色，结果以说明书给定参考值设置的酶标仪判断结果为准。

1.4.2 干血棉球样品处理液 取含有200μL血清样品的干血棉球置于试管中，加生理盐水200μL，混匀，溶解20～30 min，3 000 r/min离心15 min,取上清液（样品处理液）备用。

1.4.3 改进ELISA 在ELISA法中，第1步加入阴性、阳性对照，待检样品由50μL改为100μL，温育时间由30 min改为60 min；其他步骤和试剂用量同试剂说明书。

1.4.4 20份37℃储存3周S/CO 比值在1～3的弱阳性血清，按ELISA说明书和改进ELISA两种方法检测。

2 结果

298份血清样品用ELISA试剂盒说明书方法检测，HIV抗体阳性100份；经37℃储存3周的298份相同血清干血棉球样品处理液，用改进ELISA方法检测，HIV抗体阳性99份。两种样品HIV抗体检测结果符合率为99.0 %，经x2检验，相同的血清干血棉球与血清样品检测结果之间差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 两种方法检测相同血清样品HIV抗体结果比较

20份S/CO值在1～3的HIV抗体弱阳性样品，其37℃储存3周的干血棉球样品处理液用ELISA法检测，HIV抗体阳性11份，而用改进ELISA检测，HIV抗体阳性20份。经x2检验，两种检验方法结果有所不同（P＜0.05）；说明用ELISA法检测37℃储存3周的干血棉球样品处理液，有部分弱阳性样品出现假阴性结果，而用ELISA改进方法检测结果均为阳性。见表2。

表2 干血棉球用说明书和用改进方法检测HIV抗体弱阳性结果比较

3 讨论

干血棉球样品处理液在37℃储存3周，用改进ELISA检测HIV抗体，与相同血清样品按ELISA法说明书操作，检测结果比较，两种样品HIV抗体检测结果符合率为 99%，经x2检验，两种检验方法差异无统计学意义（P＞0.05）；干血棉球集合了血清样品和滤纸片样品二者的优点，既有容量大、易于储存和运输等优点，也可用干血棉球代替血清样品用于HIV抗体的检测。

37℃储存3周的干血棉球，会引起HIV抗体活性降低，用生理盐水溶解，又会引起HIV抗体浓度降低，HIV抗体弱阳性样品，按ELISA检测，会出现假阴性结果；但通过对ELISA方法稍作改进，即增加待检样品量（50～100 μL），同时延长抗原-抗体反应（温育）时间（30～60 min），可避免这一现象发生。用改进ELISA检测干血棉球与相同血清样品按试剂说明书检测结果比较，经x2检验，差异无统计学意义（P＞0.05）；改进ELISA在实验原理、操作步骤与试剂盒说明书完全相同，可用改进ELISA检测干血棉球HIV抗体。

[1] 张俊平,马改娣,张孟尚,等.抗人球蛋白法与酶法检测ABO血型免疫抗体效价的比较[J].中国现代医生，2009，47（30）：59.

[2] 孔繁生.一种保存干燥血清标本的器具：中国，200520028244 [P].2006-04-05.