人乳头瘤病毒DNA联合液基薄层细胞学检测在宫颈癌筛查诊断中的研究

杨忠明，丁显平，庞博，周小燕，周丽，谢芳贤

（1.四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室遗传医学研究所，四川 成都 610064；

2.四川省彭州市中医医院肿瘤科，四川 彭州 611930；3.四川省彭州市中医医院分子生物学实验室，四川 彭州 611930；

4.四川省彭州市中医医院病理科，四川 彭州 611930；5.四川省彭州市中医医院妇科，四川 彭州 611930）

许多研究表明，宫颈癌的发病与人乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV）密切相关，99%以上的宫颈癌有HPV感染，HPV是宫颈癌的主要致病因子［1］，近年这些发现已引起了学者们的高度重视。统计显示，我国每年宫颈癌新发病例13.5万，约占世界的1／4，宫颈癌与HPV感染有明确关系［2］。目前，许多国家已经逐步展开了HPV感染与宫颈癌的筛查工作。文献表明HPV各个亚型的感染存在地区分布差异。我国地广人多，虽然也有部分地区报道了HPV亚型分布情况，但覆盖范围非常有限。大量研究表明宫颈癌是一个可以预防的疾病，其潜伏期长，早期发现及时治疗，预后较好，5年生存率高达90%以上，因此其筛查和预防具有十分重要的意义。为探讨本地区妇女HPV感染及HPV亚型的分布状况，我们采用HPV检测和薄层液基细胞学技术（thin prep liquid－based cytology test，TCT），结合阴道镜指示下定位活检，发现其在宫颈癌及癌前病变的早期诊断方面具有重要的意义，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象

进行HPV筛查妇女1080例，均为2010年1月～2011年11月在本院门诊检查的、有3年以上性生活史、早婚早育、多个性伴侣、多产、有慢性宫颈病变和宫颈癌家族史之一的妇女，年龄25～71岁，取材要求为月经干净期，48h内无性生活史，白带检查清洁度正常。

1.2 标本采集

采用专用宫颈刷收集宫颈分泌物中的脱落细胞，将毛刷头置于保存液中用于HPV基因分型检测；先以窥阴器暴露宫颈，用棉拭子将宫颈口分泌物擦去，取出宫颈刷置于宫颈口，单方向旋转4～5次，然后将宫颈刷头部放入洗脱管中，沿刷柄折痕处将宫颈刷柄折断，旋紧洗脱管盖，做好样本标识，将洗脱管直立放置。阴道镜指示下宫颈活检：窥阴器扩开阴道暴露宫颈，拭净宫颈表面分泌物，然后涂碘，在病变最严重的部位多点取材活检。

1.3 试剂和仪器

HPV基因分型检测试剂盒由深圳亚能生物技术有限公司提供，能同时检测23种亚型，包括18种高危亚型：HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、83、MM4；5种低危亚型：HPV6、11、42、43、44。基因扩增仪为上海宏石公司适时荧光定量SL型PCR扩增仪，杂交用江苏兴化市分析仪器厂FYY－3型分子杂交仪；此外还有巴氏染色液和显微镜等。

1.4 方法

1.4.1 HPV基因分型检测 常规提取宫颈分泌物HPVDNA、PCR扩增、杂交、洗膜、显色、膜条扫描与保存、读取结果，具体操作按照说明书进行；组织病理学诊断常规制片、巴氏染色、镜检分析。

1.4.2 液基细胞学诊断方法 采用2001年TBS分类法［3］。①正常或炎症（within normal limits，WNL）；②未明确诊断意义的不典型鳞状上皮细胞（atypical squamous cell of undetermined significance，ASC－US）；③低级别鳞状上皮病变（low－grade squamous intraepithelial lesion，LSIL）；④高级别鳞状上皮病变（high－grade squamous intraepithelial lesion，HSIL）；⑤鳞状上皮癌（squamous cell carcinoma，SCC）；⑥不明意义的不典型腺细胞（atypical glandular cell of undetermined significance， AGC－US ）； ⑦ 腺 癌（adenocarcinoma，AC）。

1.4.3 宫颈活检病理检查 采用阴道镜指引下多点活检送病理科检查。按TBS方案统一组织学和细胞学诊断术语，LSIL宫颈上皮内瘤变I级（grade 1cervical intraepithelial neoplasia，CINⅠ）和宫颈HPV感染，HSIL含CINⅡ及其以上病变（CINⅢ）。

2 结果

1080例标本中HPV阳性315例，HPV总感染率为29.17%。共检测出20种基因亚型，包括16种高危型基因HPV16、18、31、33、35、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、83和4种低危型基因 HPV6、11、42、43基因型别（见表1，2）。高危型基因HPV感染共计331例，结果主要包括HPV16感染134例（12.41%），HPV58感染86例（7.96%），HPV52感染28例（2.59%），HPV33感染27例（2.50%）等；高危基因型别中HPV16、HPV58检出率明显高于其他基因亚型，并且HPV52、33检出率也较高（见表1）。低危基因型HPV感染共计61例，结果主要包括 HPV6感染11例（1.01%）、HPV11感染16例（1.48%），HPV43感染29例（2.69%）等；HPV低危型基因阳性病例较少，明显低于高危型基因阳性病例；HPV43感染病例较高（见表2）。HPV阳性年龄同样主要集中在44岁以下，以35～44岁最为显著，该年龄段是HPV感染高危人群。部分患者同时存在高危基因、低危基因两组HPV亚型和多个亚型HPV感染。

表1 1080例标本HPV高危型基因组检测结果（阳性例数）Tab.2 Testing results of HPV high－risk genes in 1080cases specimens（positive humber of cases）

表2 1080例标本HPV低危型基因组检测结果（阳性例数）Tab.2 Testing results of HPV low－risk genes in 1080cases specimens（positive humber of cases）

对1080例标本HPV基因亚型数目进行统计，HPV基因亚型单项阳性237例（21.94%），两项阳性57例（5.28%），三项阳性20例（1.85%），四项阳性1例（0.09%）（见表3）；单个HPV基因型别阳性病例最高，其次两个基因型别阳性较高，而3个基因以上阳性病例明显减少。HPV阳性年龄主要集中在44岁以下253例（80.3%），其中以35～44岁最为显著，162例（51.4%）。

表3 1080例标本HPV基因数目检测结果（阳性例数）Tab.3 Testing results of HPV gene numbers in 1080cases specimens（positive humber of cases）

对1080例检测发现的315例HPV阳性者进行液基细胞学检查，细胞学诊断阳性者146例，占13.52%，其中未明确诊断意义的不典型鳞状细胞（ASC－US）93例、LSIL 35例、HSIL 8例、SCC 2例、不典型腺细胞（AGC－US）8例。所有细胞学阳性病例行阴道镜下定位活检，结果显示，活检组织HPV阳性133例，符合率为91.10%；发现CIN 35例，其中CINⅠ23例，CINⅡ4例，CINⅢ8例；发现癌变5例，其中SCC 3例，腺癌1例，原位癌1例；所有CIN和癌变患者组织学标本行HPV检测，结果发现全部HPV感染，并且以HPV16（26例）和 HPV58（12例）基因型别为主，其余HPV18和HPV52基因型别各1例。

3 讨论

宫颈癌是一种严重危害妇女健康的恶性肿瘤，发病率在女性恶性肿瘤中居第2位，在一些发展中国家和地区仍居第1位［4］。现已明确HPV感染是宫颈癌发生的主要病因［5］，并且HPV的感染使宫颈癌的相对危险性增加250倍［6］，因此HPV检测目前已作为宫颈癌初筛的重要手段之一。对本地区1080例标本HPV基因亚型的研究，发现比较常见的基因亚型是HPV16、HPV58和HPV18型，并且HPV58的感染率超过了 HPV18；这与Lee等［7］对南韩地区患者进行HPV分型研究的结果以及日本学者的研究相符合；与IARC［8］近年公布的15种最常见的 HPV亚型中，以HPV16感染率最高，HPV18次之不相符合，从而证实了HPV感染存在地区差异。此外，研究还发现本地区HPV33的感染率也较高，而HPV33亚型感染在我国报道较少；HPV感染以单项基因为主，发生CIN和癌变患者与HPV16、HPV58感染密切相关。TCT检查国内外已普遍采用TBS分类系统，该系统比传统的宫颈刮片细胞学检查的巴氏5级分类法具有更严格的标准，又能很好地反应癌前病变，并且阳性率较高，因此TCT检查值得推广应用。本研究证实，HPV阳性年龄主要集中在44岁以下，以35～44岁最为显著，该年龄段是本地区HPV感染高危人群；因此进行HPV、TCT检查并联合阴道镜活检十分重要；只有做好HPV、TCT检查并联合阴道镜活检筛查工作，才能早期发现、早期诊断和早期干预宫颈的癌前病变，从而有效预防宫颈癌发生，降低宫颈癌的发病率和死亡率。

［1］吴有利，陆学东，刘键，等.膜杂交多重检测技术在HPV基因分型中的应用［J］.中华微生物学和免疫学杂志，2005，25（12）：1048.

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［3］Solomon D，Davey D，Kurman R，et al.The 2001Bethesda System：terminology for reporting results of cervical cytology［J］.JAMA，2002，287（16）：2114－2119.

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［5］廖丹梅，黄明春，李惠珍，等.TCT联合 HPV－DNA检测在宫颈病变中的诊断价值［J］.广西医科大学学报，2008，25（1）：58－59.

［6］李琳，张继勤，庄苏陵，等.宫颈刮片阴道镜及HPV检测在宫颈癌筛查中的应用［J］.肿瘤基础与临床，2007，20（1）：58－59.

［7］Lee GY，Kim SM，Rim SY，et al.Human papillomavirus（HPV）genotyping by HPV DNA chip in cervical cancer and precancerous lesions［J］.Int J Gynecol Cancer，2005，15（1）：81－87.

［8］Franceschi S.The IARC commitment to cancer prevention：the example of papillomavirus and cervical cancer［J］.Recent Results Cancer Res，2005，166：277－297.