蓝靛果中花色苷含量的测定及其体外抗氧化性

刘奕琳，王振宇，2＊

（1.东北林业大学 林学院，哈尔滨 150040；2.哈尔滨工业大学 食品科学与工程学院，哈尔滨150090）

花色苷是一类具有苯并吡喃结构的类黄酮化合物，具有预防心脏病、抗大脑炎症、抗癌、延缓衰老、抗辐射、清除自由基、抗氧化等多种功效[1－3]。蓝靛果是一种蓝黑色的浆果，含有丰富的天然绿色无毒的色素，是天然色素的良好来源。马自超[4]鉴定了蓝靛果色素中的主要成份是花青定-3-葡萄糖，其他少量成份是花青定-3，5-双葡萄糖、花青定-3-芸香糖、花青定-3-龙胆二糖、芍药定-3-葡萄糖。本实验通过pH 示差法[5]测定蓝靛果干物质中花色苷的含量，并测定其对羟自由基、超氧自由基、DPPH自由基和ABTS自由基的清除能力。

1 材料与方法

1.1 实验材料

蓝靛果（Loniceraedulis），采摘于大兴安岭；无水乙醇；乙酸钠；氯化钾；盐酸；DPPH Sigma公司、ABTS Sigma公司、无水乙醇、FeSO4、H2O2、水杨酸钠、焦性没食子酸、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁。

1.2 实验仪器

电热恒温鼓风干燥箱；粉碎机；电子分析天平；旋转蒸发仪；离心机；精密pH计；紫外分光光度计。

1.3 实验方法

1.3.1 蓝靛果花色苷的提取

将蓝靛果烘干后用粉碎机粉碎，取10g蓝靛果粉末，用200mL 60%乙醇溶液在常温下浸提1h，将提取物在4000r／min离心10min后真空抽滤，滤饼再重复浸提2次，合并3次上清液，在40℃下真空旋转蒸发浓缩，定容至250mL得花色苷提取液。取少量花色苷提取液，稀释至一定体积，进行光谱扫描，确定其测定波长。

1.3.2 pH示差法的原理及缓冲液的配制

花色苷的颜色随pH值的改变而发生变化，而干扰物质的特征光谱不随pH的改变而变化。为了让pH示差法更准确更灵敏，选择的2个pH处测定的花色苷的吸光值差异最显著，并且花色苷相当稳定。pH为1时，花色苷以2－苯基苯并吡喃的形式存在。pH为4.5时，花色苷以甲醇假碱的形式存在，因此选择pH为1.0和4.5[6]

pH4.5的缓冲液的制备：准确称取1.64g乙酸钠用蒸馏水定容100mL，用盐酸调pH（4.5±0.1）。

pH 1的缓冲液的制备：准确称取1.49gKCl用蒸馏水定容至100mL。准确量取1.7mL盐酸用蒸馏水定容至100mL，配制成0.2mol／L盐酸溶液，将KCl溶液与盐酸溶液以25∶67的比例混合。用KCl溶液调pH（1.0±0.1）。

1.3.3 平衡时间的确定

因为花青素在溶液介质中存在4种结构形式，这4种结构形式在某一pH下处于动态平衡，当pH改变时，动态平衡发生转移，总的趋势是pH降低时，平衡向红色的2－苯基苯并吡喃阳离子移动；pH升高时平衡向蓝色醌式移动。一定时间后达到一个新的平衡。因此提取液用缓冲液稀释后，必须先静置一段时间，等动态平衡处于稳定后，才能测定吸光值。

分别移取2份2mL花色苷提取液，分别用pH1.0和pH4.5的缓冲溶液定容至50mL，在所选择的测定波长下测定吸光值，每隔10min测定一次吸光值，直至稳定。

血液中甘油三酯含量反映了机体对脂类的利用情况，甘油三酯含量越低意味着对机体脂肪的利用率越高。本试验添加过瘤胃脂肪后，处理组甘油三酯含量均较对照组低（P＞0.05），说明处理组脂肪利用率较对照组高。

1.3.4 经验公式的选择

花色苷含量（%，w／w）＝（A／εL）×MW×DF×V／Wt×1000

式中：A－吸光度；ε－矢车菊花素-3-葡萄糖苷的消光系数，26900；DF－稀释因子；MW－矢车菊花素-3-葡萄糖苷的分子量，449.2；V－最终体积，mL；Wt－产品重量，mg；L－光程，1cm；A＝ApH1.0－ApH4.5。

1.3.5 抗氧化指标的测定

1.3.5.1 羟自由基清除能力的测定。参照徐建国等[7]采用的水杨酸钠络合法略作改动，测定样品清除羟自由基的能力。反应体系中依次加入样品液1mL，浓度为6mmol／L FeSO4溶液2mL，浓度为6mmol／L H2O2溶液2mL，将反应体系混合均匀放置10min，再加入浓度为6mmol／L水杨酸钠溶液2mL，静置30min后于510nm波长下用蒸馏水调零，并测定吸光值A1；将上述体系中的水杨酸钠溶液用相同体积的蒸馏水代替，其他操作相同，测定吸光值A2；将上述体系中的样品溶液用相同体积的蒸馏水代替，其他操作相同，测定吸光值A0。羟自由基清除率（%）＝[1－（A1－A2）／A0]×100%。

1.3.5.2 超氧自由清除能力的测定。参照郭雪峰[8]方法略作改动，测定样品清除超氧自由基的能力。反应体系中依次加入浓度为50mmol／L Tris-HCl溶液5.7mL，样品溶液0.2mL，浓度为6mmol／L邻苯三酚溶液0.1mL，将混合物反应4min，滴入2滴HCl终止反应，在320nm波长下测定吸光值A1；将邻苯三酚用等体积的蒸馏水代替，其他操作相同，测定吸光值A2；将样品溶液用等体积的蒸馏水代替，其他操作相同，测定吸光值A0。超氧自由基清除率（%）＝[1－（A1－A2）／A0]×100%。

1.3.5.3 DPPH自由基清除能力的测定。参照Blois等[9]的方法略作改动，测定样品清除DPPH自由基的能力。配制0.2mmol／L DPPH乙醇溶液，放在棕色试剂瓶中于4℃保存，在试管中加入2mL DPPH乙醇溶液及2mL样品溶液，混合均匀在室温避光放置30min，于517nm波长下用无水乙醇调零，并测定吸光值A1；将DPPH乙醇溶液用等体积的无水乙醇代替，其他操作相同，测定吸光值A2；将样品溶液用等体积无水乙醇溶液代替，其他操作相同，测定吸光值A0。DPPH自由基清除率（%）＝[1－（A1－A2）／A0]×100%。

1.3.5.4 ABTS自由基清除能力的测定。参照 Wanwisa等[10]方法略作改动，测定样品清除ABTS自由基的能力。用2.6mmol／mL过硫酸钾溶液溶解ABTS甲醇溶液，配制成7.4mmol／mL ABTS储备液，室温避光静置12～24h后4℃保藏。现用时取1mL储备液用甲醇稀释54.7倍，在734nm吸光值为0.700±0.020，甲醇调零。在试管中加入2.850mL ABTS测定液及0.150mL样品溶液，混合均匀在室温避光放置2h，于734nm波长下用甲醇调零，并测定吸光值A1；将ABTS测定液用等体积的蒸馏水代替，其他操作相同，测定吸光值A2；将样品溶液用等体积甲醇溶液代替，其他操作相同，测定吸光值A0。ABTS自由基清除率（%）＝[1－（A1－A2）／A0]×100%。

2 结果与分析

2.1 测定波长的确定

蓝靛果花色苷的提取液经稀释后，经光谱扫描如图1所示，确定其最大吸收波长为531nm。

图1 光谱扫描曲线

2.2 平衡时间的确定

表1 蓝靛果花色苷在缓冲溶液中的吸光值与时间变化关系

2.3 蓝靛果干物质中花色苷的含量

由表1中的数据，取平衡时间60min，根据经验公式计算得花色苷的含量（%，w／w）＝（A／εL）×MW×DF×V／Wt×1000＝（1.500－0.328）×0.250×25×449.2×1000／（26900×10×1）＝12.232mg／g。

2.4 清除羟自由基的能力

羟基自由基（·OH）是化学性质最活泼的一种自由基，建立一种Fenton反应产生羟基自由基的方法，以VC作为阳性对照组，测定其清除率如图2所示。

图2 样品对羟自由基的清楚能力

由图2可以看出，花色苷对羟自由基的清除率随质量浓度的增加而增大，并呈现明显的量效关系，而且清除率比VC对照组高，当质量浓度为0.2mg／mL时，花色苷的清除率为90.35%，VC的清除率为58.31%，可见蓝靛果花色苷对羟自由基有极强的清除能力。

2.5 清除超氧自由基的能力

超氧阴离子自由基（O2—·）是生物体中产生量最多的一种氧自由基。由邻苯三酚的方法，以VC作为阳性对照组，测定其清除率如图3所示。

图3 样品对超氧自由基的清除能力

由图3可以看出，花色苷对超氧自由基的清除率随质量浓度的增加而增大，并呈现明显的量效关系，但清除率比VC对照组低，当质量浓度为0.2mg／mL时，花色苷的清除率为87.35%，VC的清除率为97.53%，可见蓝靛果花色苷对超氧自由基有一定的清除能力。

2.6 清除DPPH自由基的能力

二苯基苦味肼基自由基（DPPH·）是一种稳定的以氮为中心的自由基，花色苷等抗氧化剂能与其结合使溶液颜色变淡，以VC作为阳性对照组，测定其清除率如图4所示。

由图1可以看出，花色苷对DPPH自由基的清除率随质量浓度的增加而增大，并呈现明显的量效关系，但清除率比VC对照组低，当质量浓度为0.2mg／mL时，花色苷的清除率为84.39%，VC的清除率为96.74%，可见蓝靛果花色苷对DPPH自由基有较强的清除能力。

图4 样品对DPPH自由基的清除能力

2.7 清除ABTS自由基的能力

ABTS[2，2＇-边氮基－双（3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸）]是一种供氢体。该方法作为一种用于体外测定物质总抗氧化能力的新方法，以VC作为阳性对照组，测定其清除率如图5所示。

图5 样品对ABTS自由基的清除能力

由图5可以看出，花色苷对ABTS自由基的清除率随质量浓度的增加而增大，并呈现明显的量效关系，而且清除率比VC对照组高，当质量浓度为10μg／mL时，花色苷的清除率为87.98%，VC的清除率为60.52%，可见蓝靛果花色苷对ABTS自由基有极强的清除能力。

3 结论

蓝靛果是具有花色苷的一种浆果，实验用pH示差法测定花色苷含量，方法可靠准确，结果显示其花色苷在干物质中的含量为12.232mg／g，可见其含量丰富。

蓝靛果花色苷对四种自由基都具有较强的清除能力，对于羟自由基和ABTS自由基的清除能力较VC阳性对照组强，而对于超氧自由基和DPPH自由基的清除能力较VC阳性对照组低，实验表明，蓝靛果花色苷具有较强的抗氧化性，可以作为天然绿色的抗氧化剂，广泛应用于食品、化妆品、药品等领域，具有很大的发展前景。

[1]李韬，张宏宇，吕玉璋.花色苷类色素的研究进展[J].农业科技与装备，2010（5）：23-26.

[2]倪勤学，霍艳荣，陆国权.花色苷保健功能的研究进展[J].安徽农业科学，2010，38（35）：20025-20028.

[3]Nozomu Matsunaga，Kazuhiro Tsuruma，etal.Inhibitory Actions of Bilberry Anthocyanidins on Angiogenesis[J].Phytother Res，2010，24（1）：42-47.

[4]马自超.蓝靛果中花青素色素的研究[J].中国野生植物资源，1996（2）：1-3.

[5]孙建霞，张燕，孙志健，等.花色苷的资源分布以及定性定量分析方法研究进展[J].食品科学，2009，30（5）：263-26.

[6]Lee J，Durst RW，Wrolstad RE.Determination of total monomeric anthocyanin pigment content of fruit juices，beverages，natural colorants，and wines by the pH differential method：collaborative study[J].J AOAC Int，2005，88（5）：1269-1278.

[7]徐建国，胡青平.决明子水提物体外清除自由基活性的研究[J].食品科学，2006，27（6）：73-7.

[8]郭雪峰，岳永德，汤锋，等.用清除超氧阴离子自由基法评价竹叶提取物抗氧化能力[J].光谱学与光谱分析，2008，28（8）：1823-1826.

[9]Blois ms.Antioxidant determinations by the use of a stable free radical[J].Nature，2002，26：1199-1200.

[10]Wanwisa B，Soottawat B，Wonnop V，et al.Antioxidative activity of Mungoong，an extract paste，from the cephalothorax of white shrimp（Litopenaeus vannamei）[J].Food Chemistry，2008，106：185-193.