反相高效液相色谱法测定烧伤涂膜中黄芩苷含量

张秋红，张忠义，王曙东

(1.中国人民解放军南京军区南京总医院制剂科，江苏 南京 210002;2.南方医科大学珠江医院药剂科，广东 广州 510282)

烧伤涂膜是医院中药制剂，用于治疗深、浅Ⅱ度烧伤[1]，处方中含黄芩和虎杖等。为控制制剂质量，笔者采用薄层色谱法鉴别黄芩[2]，用反相高效液相色谱法测定黄芩苷含量[3-4]，报道如下。

1 仪器与试药

高效液相色谱仪，包括Waters 1525双泵，Waters 2996二极管阵列检测器，Waters Millennium 32色谱工作站(美国Waters公司)。黄芩苷对照品(中国药品生物制品检定所);烧伤涂膜(医院自制，含黄芩、大黄、壳聚糖等);甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 黄芩薄层色谱鉴别

精密称取本品20 g，加水100 mL，用稀盐酸调pH至2，加乙酸乙酯30 mL，水浴回流提取2 h，收集乙酸乙酯液，酸水层用乙酸乙酯萃取2次，合并提取液，挥干，残渣加乙醇5 mL溶解，上14～30目聚酰胺柱，先用水洗脱至洗出液无色，再用80%乙醇洗脱，收集洗出液200 mL，回收乙醇，残渣加甲醇2 mL溶解，作为供试品溶液;精密称取黄芩苷对照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的对照品溶液;取黄芩对照药材2 g，加乙醇50 mL，水浴回流提取1 h，滤过，蒸干，残渣加水30 mL，用稀盐酸调pH至2，用乙酸乙酯萃取3次，每次15 mL，合并萃取液并挥干，残渣加乙醇5 mL溶解，上14～30目聚酰胺柱，先用水洗脱至洗出液无色，再用80%乙醇洗脱，收集洗出液200 mL，回收乙醇，残渣加甲醇2 mL溶解，作为对照药材溶液;按处方称取除黄芩外的其余药材，制成涂膜剂，依供试品溶液配制方法制成阴性对照品溶液。吸取上述4种溶液各10 μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以正丁醇-醋酸-水(4 ∶2 ∶1)为展开剂，展开，晾干。日光下呈绿色，紫外光灯(365 nm)下呈褐色。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液和对照品溶液色谱相应位置上有相同斑点，阴性对照品溶液则无此斑点(图1)。

图1 黄芩薄层色谱图

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件

色谱柱:Lichrospher C18柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相:甲醇-0.2%磷酸(55∶45);流速:1.0 mL/min;检测波长:280 nm;柱温:室温。

2.2.2 溶液制备

精密称取黄芩苷对照品5.99 mg，配成质量浓度为3.00 g/L的对照品贮备液。分别取3批样品各20 g，加水20 mL，用稀盐酸调pH至2，加乙酸乙酯20 mL，水浴加热回流2 h，放冷，取乙酸乙酯液蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为供试品溶液;取不含黄芩的阴性样品，同法制备阴性对照品溶液。

2.2.3 方法学考察

系统适用性试验:吸取2.2.2项下3种溶液，分别注入色谱仪，记录色谱图。黄芩苷的保留时间约为5.9 min，阴性对照品溶液在此处无干扰峰，说明对样品含量测定无干扰。理论塔板数以黄芩苷计不低于3 000，黄芩苷色谱峰与相邻未知色谱峰的分离度不低于1.4。色谱见图 2。

图2 高效液相色谱图

线性关系考察:精密吸取对照品贮备液1.5 mL，置2 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。再精密吸取稀释液1.5 mL，置2 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，使黄芩苷质量浓度分别为 3.000，2.250，1.688，1.266，0.949，0.712 g/L，取10 μL进样测定峰面积。以峰面积(A)对质量浓度(C)进行线性回归，得回归方程 A=2.93×107C+2.58×106，r=0.998 2(n=6)。结果表明，黄芩苷质量浓度在0.712～3.00 g/L范围内与峰面积有良好的线性关系。

精密度试验:精密称取同一对照品溶液，重复进样6次。结果黄芩苷峰面积积分值的 RSD为0.97%(n=6)。

稳定性试验:取同一供试品溶液，依法测定峰面积5次，每次间隔1 h。结果的 RSD=0.43%(n=5)，表明供试品溶液在4 h内稳定。

重现性试验:取同一批号的样品，依法制备供试品溶液并测定含量。结果的 RSD=0.93%(n=6)，表明方法重现性良好。

加样回收试验:精密称取黄芩苷对照品适量，配成质量浓度为1.134 g/L的溶液，作为标准加样贮备液。另精密称取样品(批号为091027)10 g，共6份，分别加入上述标准加样贮备液0.7，1.0，1.2 mL，按供试品溶液制备方法制成加样回收样品液，取10 μL进样，测定含量，计算回收率。结果见表1。

表1 黄芩苷加样回收试验结果(n=6)

2.2.4 样品含量测定

依法测定3批样品，结果黄芩苷含量分别为113.7，113.6，113.7 μg/g。

3 讨论

薄层色谱法是含黄酮类成分中药制剂最常用的定性分析方法。一般采用吸附薄层色谱，常用的吸附剂为硅胶与聚酰胺。聚酰胺特别适合于分离含游离酚羟基的黄酮及其苷类，黄芩苷正是含有游离酚羟基的黄酮苷类，故在样品提取过程中使用聚酰胺柱吸附黄酮苷。洗脱时先用水洗去杂质，再用80%乙醇洗脱黄芩苷，以使鉴别效果理想。

关于高效液相色谱法测定黄芩中黄酮苷类成分的报道较多，多采用流动相梯度洗脱，且都选择水、乙腈和无机酸类。试验发现，甲醇、水和磷酸组成的流动相分离效果理想，且更为经济。笔者通过二级管阵列检测器，在200～400 nm波长范围内对样品进行光谱扫描，提取各组分在不同波长处的三维光谱图进行对比分析，最后选280 nm作为测定波长。在此波长处被测组分有灵敏的响应值，同时此波长也是测定黄芩苷时杂质峰干扰最小处。

[1]解伟光.烧伤患者能量消耗的基本变化[J].医学研究生学报，2007，20(3):269-271.

[2]刘英学，刘中刚，苏 兰，等.黄芩化学成分研究[J].中国药物化学杂志，2009，19(1):59-62.

[3]张守尧，郭友立，王秉钧，等.微乳液相色谱法测定黄芩苷的含量[J].南方医科大学学报，2009，29(1):179-180.

[4]汤小蕾，孙平飞.HPLC法测定黄芩分散片中黄芩苷的含量[J].中药材，2009，32(9):1 471-1 472.