病原真菌外排转运蛋白与真菌耐药的研究进展

廖 勇，敖俊红，杨蓉娅

• 综 述 •

病原真菌外排转运蛋白与真菌耐药的研究进展

廖 勇，敖俊红，杨蓉娅

病原真菌通过对抗机体防御系统和抗真菌药物的攻击,从而成功定植于宿主体内并最终导致机体感染, 真菌外排转运蛋白在上述过程中起着重要作用，主要包括ATP结合盒转运蛋白（ATP-binding cassette transporters，ABC）与主要易化子超家族（the major facilitator superfamily，MFS），分别通过与ATP水解酶或质子梯度耦合来运输并清除真菌胞内的毒性物质。与其它生物相比，真菌基因组中具有更多转运蛋白家族编码基因，这些转运蛋白不仅对真菌致病过程中所产生的代谢产物和宿主细胞分泌的抗菌成分起外排作用；同时，在病原真菌对抗临床抗真菌药物中也发挥着重要作用。本文就这两个超家族的转运蛋白在主要病原真菌耐药性中所发挥的作用进行综述。

病原真菌；外排转运蛋白；耐药；进展

深部真菌病的发病率在近二十年迅速上升[1]，其中，白念珠菌在所有常见血源性致病真菌中已位列第四。念珠菌属、隐球菌属、曲霉菌属、镰刀菌属和接合菌属等病原真菌均能够适应机体环境，且其所引起的深部真菌病均具有较高死亡率。病原真菌不断受到外源性毒性成分的攻击，这些化合物可以是其他微生物为争夺有限生存资源而合成的成分，也可能是机体的防御体系主动合成，或是其他来源的抗真菌物质。不论其来源，这些化合物迫使真菌通过进化来适应周围环境并生存下来。对抗这些抗真菌化合物的常见机制就是通过细胞膜表面的外排转运蛋白将其主动外排，从而减少其在真菌胞内的积聚，使其对于毒性物质产生耐受。研究发现，这些转运蛋白是真菌重要的毒力因子，部分转运蛋白已证实其功能涉及真菌致病性的多个方面，包括钙铁摄取，通道运输，应激耐受和菌相转换等。本文重点讨论ATP结合盒（ABC）转运蛋白和主要易化子超家族（MFS）与主要病原真菌耐药的关系。

1 病原真菌外排转运蛋白的种类及功能

真菌基因组中约每百万碱基存在10～30个转运蛋白的编码基因，比例明显高于其它生物，对目前已完成测序的真菌基因组研究发现ABC和MFS为最常见的转运蛋白超家族，其编码基因约占真菌基因组所有转运蛋白编码基因的50%。尽管ABC和MFS在真菌致病过程中发挥重要作用，但其编码基因的数量与真菌致病性之间未发现明确相关性，如构巢曲霉和烟曲霉的基因组中都含有45个编码ABC转运子的基因，构巢曲霉具有更多的MFS基因，但其致病性远低于烟曲霉。

ABC转运蛋白是主要的外排泵转运蛋白，主要包括ABCA、ABCB、ABCC、ABCD和ABCG五个转运子家族（其中三个家族ABCB、ABCC和ABCG）与胞内毒性物质的外排密切相关，分别称为多药耐药家族（MDR）、多药耐药相关蛋白家族（MRP）以及多效性耐药家族（PDR）[2]。ABC可通过水解三磷酸腺苷（ATP）供能将物质从细胞内排出。在酵母菌和丝状真菌中均发现ABC转运蛋白中的多效性耐药家族（PDR）基因存在缺失或多拷贝，表现出较低的进化保守性，表明该家族的成员在外界选择性压力下可以迅速发生适应性反应。MFS转运蛋白包括17个转运蛋白家族，其中两个家族，药物：H+逆向转运子（14跨膜片段）（DHA14）和药物：H+逆向转运子（12跨膜片段）（DHA12）与外排毒性物质功能相关[3]。

2 外排转运蛋白与真菌耐药

病原真菌能够在抗真菌治疗的过程中产生耐药性，多种因素可以导致病原真菌耐药性升高，药物外排转运蛋白的转录增加是其重要因素之一，而相关转录激活因子的表达上调在其中起到重要作用[4]。ABC转运蛋白虽不直接参与真菌的致病过程，但可为具有耐药性的病原真菌提供“定植”优势。研究发现白念珠菌的CDR1和CDR2；克柔氏念珠菌的ABC1 和ABC2；光滑念珠菌的CgCDR1、PDH1（也称为CgCDR2）和SNQ2；烟曲霉的AtrF以及新生隐球菌的CneAFR1和CneMDR1[5-7]与三唑类抗真菌药物（氟康唑、伊曲康唑、酮康唑、泊沙康唑以及伏立康唑）的单一耐药或交叉耐药相关，但与棘白菌素类抗真菌药物及人组蛋白-5（抗真菌蛋白）的耐药不相关[8]。白念珠菌的MFS转运蛋白如MDR1和FLU1 与真菌的耐药性相关[9]。与ABC转运蛋白不同， MFS转运蛋白相对特异地与氟康唑耐药相关。

2.1 外排转运蛋白与白念珠菌耐药

白念珠菌基因组中至少含有27个ABC转运蛋白，其中7个基因的序列及功能已在白念珠菌基因组数据库（CGD）中得到注释，包括CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR11、SNQ2和YOR1，并证实或推断与白念珠耐药相关[10]。 研究发现CaCDR1和CaCDR2与抗真菌药物的外排相关，CaCDR3和CaCDR4编码磷脂转移酶，其基因序列与CaCdr1p和CaCdr2p具有高度同源性，但与白念珠菌耐药不相关[11]。白念珠菌基因组中6个MFS转运蛋白基因的功能被注释（MDR1、FLU1、TPO3、f1 9.2350、NAG3和MDR97），CaCdr1p、CaCdr2p和CaMdr1p转运蛋白是介导白念珠菌对唑类抗真菌药物耐药的膜表面外排转运蛋白。CaMdr1p可特异性引起氟康唑耐药，但CaCdr1p和CaCdr2p的特异性不强[12,13]。部分白念珠菌氟康唑耐药株高表达CaCDR1和CaCDR2，而部分耐药株只高表达CaMDR1[14]，表明唑类耐药株中至少存在两个不同的转录调控信号途径调控外排转运蛋白的表达。尽管白念珠菌氟康唑临床耐药是由多机制介导的，但高水平耐药株与CaCDR1和CaCDR2的高表达更加相关，其中CaCDR1的表达较CaCDR2更为重要[15]。对白念珠菌氟康唑耐药临床株转运蛋白表达量进行研究，结果发现CaCdr1p的表达量明显高于CaCdr2p，证明在氟康唑耐药机制中CaCdr1p起更为重要的作用。因此，CaCdr1p可以作为针对氟康唑耐药菌株的重要药物靶点进行进一步研究[16]。

2.2 光滑念珠菌

约30%的光滑念珠菌临床株对唑类抗真菌药物表现出中度先天性耐药。给予唑类抗真菌药物治疗，光滑念珠菌可较快产生对于唑类药物的获得性耐药[17]，且原有治疗药物撤除后，耐药性仍可稳定保存。光滑念珠菌可能存在18个ABC转运蛋白和15个MFS转运蛋白[2]。体外试验研究发现高表达CgCDR1基因的光滑念珠菌，可引起菌株对唑类药物耐药；而该基因的缺陷会导致菌株对唑类药物敏感性升高。光滑念珠菌ABC转运蛋白CgSNQ2与酿酒酵母转运蛋白ScSNQ2具有高度同源性，可介导唑类抗真菌药物耐药[7]。光滑念珠菌的CgPDR1和CgPDR3与白念珠菌转录因子TAC1是同源基因，可通过与底物结合，促进外排转运蛋白的表达[18]。光滑念珠菌唑类临床耐药株与敏感株相比，CgCDR1和 CgPDH1的表达量显著升高；且耐药株的CgPdh1p 存在氨基酸位点替换，导致CgCDR1表达上调及菌株对于唑类药物的耐药[19]。

2.3 克柔氏念珠菌

克柔氏念珠菌一般认为对于氟康唑先天性耐药，但对于新一代唑类抗真菌药（伏立康唑和泊沙康唑）较为敏感[20]。克柔氏念珠菌对于氟康唑先天耐药的主要机制是其与药物靶点Erg11p亲和力下降；同时，药物外排泵的高表达在其中也起重要作用[21]。Katiyar等通过对ABC转运蛋白NBDs的高度保守区域设计引物，在克柔氏念珠菌中扩增出两个ABC转运蛋白CkABC1和 CkABC2。CkABC2在不同培养条件下均为低水平表达，而CkABC1 可以在不同唑类抗真菌药的作用下表达上调[7]；将CkABC1p异源表达于酿酒酵母中，使酿酒酵母可将包括氟康唑、伊曲康唑、酮康唑及伏立康唑在内的抗真菌药物外排出细胞，说明该蛋白是药物外排转运蛋白[22]。

2.4 烟曲霉

烟曲霉基因组中可能存在49个ABC和278个MFS 转运蛋白，数量是酿酒酵母的4倍，但只有少数与烟曲霉临床耐药相关[23]。目前，对于烟曲霉ABC或MFS外排转运蛋白与抗真菌耐药性相关的数据较少。研究发现，部分唑类耐药临床株的外排转运蛋白表达量较敏感株上调。atrF基因属于ABC 转运蛋白的PDR家族，是构巢曲霉AtrA 和 AtrB转运蛋白的同源蛋白，给予该菌亚致死浓度的伊曲康唑，可使其基因表达水平上调为基础水平的5倍[24]。体外诱导烟曲霉耐药研究发现，其耐药是由药物靶位点CYP51A基因突变及药物外排泵（MDR1、MDR2、MDR3、MDR4和atrF）表达量的上调等多种机制共同作用所致[25,26]。AfuMDR1和AfuMDR2是通过ABC 外排泵特异性引物在烟曲霉中扩增出来的MDR家族转运蛋白，与构巢曲霉的AtrD和黄曲霉的AflMDR1具有高度同源性。在酿酒酵母中过量表达AfuMdr1p，可使其对西洛芬净（棘白菌素B类似物）耐受性增加[27]，但未有对其它抗真菌药物的耐药表型。烟曲霉转运蛋白abcA 属于PDR转运蛋白家族，但烟曲霉abcA基因缺陷株对于所有抗真菌药物的敏感性未发生变化。紫外线诱导突变获得的26株伊曲康唑烟曲霉耐药株中，其中8株在AfuCYP51A 的G54位点发生唑类药物耐药相关氨基酸突变；而50%的突变株AfuMDR3与AfuMDR4基因表达量明显上调[26]。AfuMDR3蛋白具有MFS家族转运蛋白的典型结构，AfuMDR4蛋白具有ABC家族转运蛋白的典型结构；但目前仍没有数据表明烟曲霉伊曲康唑耐药表型与AfuMDR3和AfuMDR4具有直接相关性，但以上研究说明药物外排转运蛋白在曲霉属真菌对唑类药物耐药的形成过程中也发挥了一定作用。

2.5 隐球菌属

新生隐球菌和格特隐球菌是重要的人类病原真菌，其两性霉素B及氟康唑耐药临床株和体外诱导突变株既往均有报道[28]。新生隐球菌可能存在54个ABC和159个MFS转运蛋白[29]，但只有CneAfr1p和CneMdr1p与新生隐球菌耐药性相关[5,30]。CneAfr1p是ABC转运蛋白PDR家族成员，与构巢曲霉AtrBp、烟曲霉AfuAtrFp、酿酒酵母ScSnq2p和光滑念珠菌CgPdh1p具有高度同源性[5]。新生隐球菌CneAfr1p高表达株在体外具有较强的唑类药物耐药性，该菌株感染的小鼠对于任何唑类药物均无治疗反应，且菌株表现出更强的致病性[30]。在给予氟康唑或伊曲康唑长期维持治疗的过程中，隐球菌会出现获得性耐药。对临床耐药株的研究发现，氟康唑中度耐药株多数发生CneERG11基因点突变，而高度耐药株则药物外排泵表达上调。CneMdr1p属于ABC转运蛋白MDR家族；与AflMDR1和AfuMDR1具有高度同源性；该基因的表达与唑类药物耐药的相关性，在新生隐球菌临床耐药株和体外诱导突变株中均得到证实。

3 结论

真菌中的外排转运蛋白，特别是ABC转运子和MFS转运蛋白超家族，在真菌致病过程中所起的作用至关重要。大量的研究证实其可将细胞内的毒性代谢产物和真菌毒素运输至胞外，清除宿主合成的抗真菌成分，使真菌对于临床抗真菌药物产生耐药。认识每个外排转运蛋白在临床真菌耐药中所发挥的作用，对于早期检测相应临床耐药株、研发特异性外排泵阻断剂及降低深部真菌感染患者的死亡率至关重要。目前，较为深入的研究主要集中于酿酒酵母和白念珠菌，而其它病原真菌具有更多的ABC和MFS转运蛋白，特别是重要的致病丝状真菌曲霉菌，仍需要进一步更为全面而深入的研究。

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The progress of research on efflux pumps in pathogenic fungi and drug resistant

LIAO Yong, AO Jun-hong, YANG Rong-ya
Department of Dermatology, General Hospital of Beijing Region of PLA., Beijing 100700, China

Only after overcoming both the host defenses system and antifungal treatment, maybe the pathogenic fungi can successfully maintain its colonization and eventually lead to the infection of the host. Efflux pumps in fungi play an important role in this process, mainly including the ATP-binding cassette (ABC) pumps and the major facilitator superfamily (MFS) transporters. Through coupling transport with ATP hydrolysis or a proton gradient respectively, they can transport and remove the intracellular toxic chemicals. Compared with other organisms, fungi have more coding genes of transporter families. These transporters of pathogenic fungi can export the compounds produced in the process of pathogenesis and antimicrobial components secreted by the host cell, meanwhile they also play an important role in resistance of the pathogenic fungi against clinical antifungals. In this review, we discussed the role of these two superfamily transporters in resistance of main pathogenic fungi.

Pathogenic fungi；Efflux pumps；Resistance；Progress [J Pract Dermatol, 2011, 4(4):215-218]

R379

A

1674-1293(2011)04-0215-04

廖 勇

2011-07-26

2011-09-14）

（本文编辑 祝贺）

国家自然基金（31050014）

100700，北京军区总院全军皮肤病诊治中心（廖勇，敖俊红，杨蓉娅）

廖勇，主治医师，研究方向：医学真菌学E-mail: liaoyong8337@yahoo.cn

敖

俊红，E-mail: aojunhong@sina.com