肺癌细胞株 E-cadherin的表达状态及其与启动子甲基化的关系

郝立宏，杨晓燕,2，宫琳琳，赵瑾瑶，宋 阳，杜 莎，王 兰，刘 鹭，熊 海,3

(1.大连医科大学 蛋白质组学实验室，辽宁 大连 116044; 2.大连医科大学 附属第二医院 肿瘤科，辽宁 大连 116027; 3.大连医科大学 附属第一医院 胸外科，辽宁 大连 116001)

肺癌已成为中国恶性肿瘤的首位死亡原因，其发生是多基因参与的多阶段、多步骤的复杂过程，是癌基因的激活和抑癌基因的失活共同作用的结果。近年对肿瘤的研究发现，抑癌基因的失活在肿瘤中扮演越来越重要的角色。上皮性钙粘蛋白(E-cadherin,CDEH1)是介导同型细胞-细胞间粘附的钙依赖性跨膜粘蛋白，具有肿瘤侵袭和转移抑制功能，被认为是肿瘤侵袭抑制因子[1]。研究表明E-cadherin在大多数肿瘤组织中呈低表达，成为预测肺癌生物学行为的重要指标；启动子区高甲基化是引起基因沉默的主要机制之一，可能影响基因功能的正常发挥[2]。本实验通过研究肺癌细胞株中E-cadherin基因启动子甲基化状态，探讨肺癌细胞中E-cadherin蛋白的表达改变的可能机制。

1 材料和方法

1.1 细胞培养

人大细胞肺癌细胞株 NCI-H460 及人肺腺癌细胞株 SPCA 和 A549 购自中国科学院肿瘤所细胞库，经大连医科大学组胚教研室长期液氮保存。实验前，常规培养于含 10% 优质胎牛血清、100 IU/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素的 RPMI-1640 培养基中，在 37℃、5%CO2的饱和湿度孵箱中传代培养。

1.2 主要试剂和仪器

E-cadherin 鼠抗人单克隆抗体、免疫组化SP超敏试剂盒和DAB显色试剂盒，购自北京中杉生物技术公司。Rnase A及 proteinase K，购于大连宝生物；SDS、氢醌(Hydroquiinone)和亚硫酸氢钠(Bisulfite)，购自 Sigma 公司。微流控芯片为中国科学院大连化学物理研究所自行研制的通用型激光诱导荧光微流控芯片。

1.3 方 法

1.3.1 免疫细胞化学方法：将无菌盖玻片至6孔板中，加入细胞悬液，37℃、5%CO2细胞培养箱内孵箱24 h后取出，PBS洗3 次，冷丙酮固定15 min；Triton X-100 37℃ 孵育 15 min；严格按试剂盒说明书操作。鼠抗人E-cadherin单克隆抗体(1∶50)。用 PBS 代替一抗做阴性对照。

1.3.2 DNA甲基化方法：取对数生长期细胞，常规提取 DNA。参见分子克隆。

DNA 亚硫酸氢钠修饰：于每份 DNA 溶液(1～2 μg/50 μL)中加入 5.5 μL 2 mol/L NaOH，37℃水浴，碱变性 10 min；加入 30 μL 0.2 mol/L 氢醌和 520 μL 3 mol/L 亚硫酸钠，50℃水浴16～20 h；将碱基转化反应后的 DNA 溶液移至 Wizard column 管中，12 000 r/min 离心1 min；加入 80% 异丙醇，12 000 r/min 离心 1 min；将 Wizard column 置于另一 Eppendorf 管中，用 50 μL ddH2O 洗脱 DNA；于洗脱液中加入5.5 μL 3 mol/L NaOH，5 min 后加入 120 μL 95% 乙醇，66 μL 5 mol/L 醋酸铵，3 μL 糖原，室温 60 min，12 000 r/min 4℃ 离心 25 min。

改良半巢式甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)：采用两对引物分别对已完成化学修饰的样本 DNA 进行 PCR 扩增。E-cadherin甲基化(M 116 bp)上游引物：taa cta aaa att cac cta ccg ac，下游引物：tta ggt tag agg gtt atc gcg t；非甲基化(U 97 bp)上游引物：cac aac caa tca ava aca ca，下游引物：taa ttt tag gtt aga ggg tta ttg t(引物由大连宝生物合成)。将5 μL 处理后 DNA 加入 200 mmol/L dNTPs、25 mmol/L 引物，2 U Taq 聚合酶，行 PCR 反应；将 PCR 产物稀释 10 倍后，取 1 μL稀释液加入相同的 PCR 试剂中，进行第二次 PCR 反应。PCR 反应条件：95℃，预变性 10 min，[95℃，变性30 s；52℃(非甲基化)或 50℃(甲基化)，退火 30 s；72℃，延伸 30 s；29 个循环]，72℃，延伸 10 min；4℃ 保存。取 15 μL PCR 扩增产物在 2% 琼脂糖凝胶中电泳。

结果判断：同时满足以下条件时判断为结果有效：以双蒸水作空白对照经甲基化引物扩增不出现相应条带，同时甲基化引物或非甲基化引物必须扩增出任何一条产物带，或者两种引物均扩增出相应产物带。若仅非甲基化引物扩增出相应片段为甲基化阴性，仅甲基化引物扩增出相应片段为完全甲基化，甲基化引物和非甲基化引物均扩增出相应片段为不完全甲基化。完全甲基化和不完全甲基化均计为甲基化检测阳性[3]。

微流控芯片甲基化检测：分离电压 150～250 V/cm，抑制电压 340～400 V/cm，进样电压 400 V/cm；将样品(5 μL PCR 产物及 5 μL marker) 加入样品池中，尽量保持各池中液面高度一致。芯片为一次性使用。

2 结 果

2.1 肺癌细胞株中 E-cadherin 蛋白的表达

NCI-H460、SPCA 和 A549 细胞的胞浆内见淡黄色或黄色颗粒，其中SPCA 中表达较强，A549 中表达最弱(图1)。NCI-H460、SPCA 和 A549 细胞以及阴性对照 SPCA 细胞中 E-cadherin 蛋白表达的平均灰度扫描结果分别为：0.09±0.018、0.11±0.024、0.05±0.020和0.02±0.010。

图1 E-cadherin在肺癌细胞株中的表达 (SP法 ×400)

2.2 MSP 法 E-cadherin基因启动子甲基化的检测结果

NCI-H460、SPCA 和 A549 细胞株中均可见明显的E-cadherin基因启动子甲基化引物的产物带(图2)，其中 NCI-H460 中还可见明显的非甲基化的产物带，SPCA 中见一弱的非甲基化的产物带，A549 中的非甲基化的产物带更弱(图2)。

2.3 微流控芯片检测E-cadherin基因启动子甲基化的结果

NCI-H460、SPCA 和 A549 细胞株中分别经甲基化引物扩增后的 DNA 经过微流控芯片后均可见明显的波峰，NCI-H460 和 SPCA 中非甲基化引物可见低的波峰，A549 细胞株中无非甲基化波峰。其中 NCI-H460 细胞株甲基化和非甲基化产物的微流控芯片检测结果见图3。

图2 肺癌细胞中E-cadherin基因启动子甲基化检测

图3 NCI-H460 细胞中E-cadherin基因启动子甲基化检测结果

3 讨 论

近年来，陆续报道了一系列重要的肿瘤相关基因，如钙粘素、层粘连蛋白等。但这些基因在肿瘤中发生改变的机制尚不明了，尽管它们在肿瘤中的表达普遍下调，但其遗传改变的发生率却极低。目前认为表观遗传学的改变，如 DNA 甲基化、组蛋白修饰和染色质区室的严重紊乱是人肿瘤的共同特点[4]，尤其是 CpG 岛超甲基化引起相关基因沉默，有可能解释众多基因的异常表达[5]。E-cadherin 是钙粘附蛋白家族中经典亚族成员，是维持正常上皮完整性和极性的跨膜糖蛋白，其表达下调或不表达是上皮细胞离散的分子基础[6]。近年来研究表明 E-cadherin 具有肿瘤侵袭和转移抑制功能，被认为是肿瘤侵袭抑制因子[1]。在对肿瘤的研究中发现抑癌基因的失活通常是由于基因突变、缺失、异常甲基化所致[7,8]。E-cadherin基因启动子区域 CpG 岛高度甲基化可能改变染色体局部构象，从而阻止转录因子与相应启动子结合而抑制转录过程。

本研究在对肺癌组织和癌旁肺组织中 E-cadherin 蛋白表达的检测中发现，该蛋白在肺癌组织中表达下调，尽管在肺癌组织和配对的癌旁肺组织中均有E-cadherin基因染色体的点突变发生，但二者的突变率没有明显差异，可能基因突变不是引起E-cadherin 蛋白下调的唯一因素(另文发表)。为探讨肺癌中 E-cadherin 蛋白异常改变的机制，作者在 NCI-H460、SPCA 和 A549 细胞株中检测到E-cadherin蛋白均下调，提示E-cadherin 蛋白在肺癌细胞株中呈低表达，此三种细胞可以作为实验模型，其中尤以 A549 细胞中下调的更为明显。通过半巢式甲基化特异性 PCR 法(MSP)在三种细胞中均检测到了E-cadherin基因启动子的高甲基化改变，表明在三种肺癌细胞株中均有E-cadherin基因启动子甲基化的发生；在细胞中出现非甲基化产物带分析是由于细胞的 DNA 甲基转化不完全所致，A549 细胞中E-cadherin基因启动子甲基化最完全。用敏感性更高的微流控芯片技术[9]对三种细胞的 PCR 产物进一步检测的结果与 MSP 法检测的结果一致性很高，表明三种肺癌细胞株均发生了E-cadherin基因启动子甲基化，在 A549 细胞中E-cadherin基因启动子甲基化程度最高，这一结果与免疫细胞化学法检测三种细胞中 A549 细胞的E-cadherin 蛋白表达最低相一致，分析其原因是由于在A549 细胞中E-cadherin基因启动子充分发生了甲基化所致。结果提示，E-cadherin基因启动子高度甲基化可能是 E-cadherin 蛋白表达下调的主要原因。

CpG 岛的异常甲基化是肿瘤中的普通现象，而且这些甲基化改变通常发生于细胞恶变之前，因此甲基化可能成为肿瘤早期诊断的标记物。临床血浆检测是一种微创的的检测方法，作者已经应用微流控芯片技术在血浆中进行了p16基因异常甲基化的检测[9]，建立了应用微流控芯片技术检测基因甲基化改变的平台。本实验结果提示E-cadherin基因启动子高度甲基化与 E-cadherin 功能异常有关。王红兵等[10]在对肺癌组织与癌旁肺组织和正常肺组织的研究中认为肺癌组织中存在E-cadherin基因启动子的异常甲基化，王洪涛等[11]报道E-cadherin启动子区域的 CpG 岛异常高度甲基化引起 E-cadherin 蛋白表达的下调，这些报道均提示E-cadherin基因启动子高度甲基化与 E-cadherin 功能异常密切相关。Saito K等[12]认为CDH13 和RASSF1甲基化是 IA 期非小细胞肺癌预后不良的独立标记。因此作者认为，E-cadherin基因启动子高度甲基化也有可能成为早期诊断的标记，如果在临床肺癌患者血浆中也能检测到这种异常甲基化改变，将在临床中有很大的应用价值，相关研究将继续进行。

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