乌苏里藜芦生物碱单体计米丁的抗动脉血栓作用

吕 莉，潘 平，韩国柱，周 琴，赵伟杰，王世盛，陆文婷

(1.大连医科大学 药理教研室，辽宁 大连 116044；2.大连理工大学 精细化工国家重点实验室，辽宁 大连 116012；3.大连友谊医院 药剂科，辽宁 大连 116001)

藜芦(Veratrumnigrum) 系百合科多年生草本植物，《神农本草经》及《本草纲目》等均有记载。《中药大词典》等称“藜芦可用于治疗中风失语、黄疸、疥疮”等[1]，由此提示藜芦可能具有抗血栓等方面的作用。本研究组一直致力于研究乌苏里藜芦的有效成分及其药理作用，既往研究表明从藜芦中提得的总碱具有降压[2]、改善血流动力学[3,4 ]、中枢抑制作用[5]，并首次发现了藜芦总碱具有强大的抗动、静脉血栓作用[6]。本工作组对其生物总碱进行了一系列的化学成分研究，迄今已分离出11种酯型异甾体生物碱[7-9]，其中的一种单体经用现代分析技术鉴定为计米丁(germidine)[10,11]，其化学结构如图1所示。本文旨在研究计米丁的抗动脉血栓作用，从而确定乌苏里藜芦生物碱的抗血栓活性成分。

图1 计米丁的化学结构

1 材料和方法

1.1 药物及试剂

盐酸计米丁注射液(500 μg·mL-1)由大连理工大学化学制药系提供；赖氨匹林(Aspirin-DL-Lysine,LAS)，安徽安宝药厂产品；ADP，美国Sigma公司产品。

1.2 动 物

SD大鼠，雄性，180～220 g，清洁级，大连医科大学实验动物中心提供，合格证号SCXK(辽)2008-0002。

1.3 仪 器

LBY-NJ2型普利生血液凝聚仪，北京普利生仪器公司产品；BT87-3型体内血栓形成测定仪，包头医学院心血管研究室产品。

1.4 方 法

1.4.1 血流阻塞时间(OT)的测定

大鼠70只，随机分为7组：生理盐水(NS)组，计米丁1.3 μg·kg-1、2.5 μg·kg-1、5.0 μg·kg-1、10.0 μg·kg-1和20.0 μg·kg-1组，以及阳性对照药物赖氨匹林(LAS)18.0 mg·kg-1(相当于阿司匹林10.0 mg·kg-1)组。大鼠腹腔注射乌拉坦1 g·kg-1麻醉，分离一侧颈总动脉，将体内血栓形成仪的刺激电极置于颈总动脉近心端，远心端置一温度传感器，大鼠舌下静脉注射受试药物后20 min以强度为1.6 mA直流电连续刺激颈总动脉7 min，引起血管内膜损伤，从而形成血栓。记录从电刺激开始到温度骤降所需时间，即血流阻塞时间(Occlusion Time,OT)[6,12]。以NS组为基准，计算不同给药组OT延长百分率。

1.4.2 体内血小板聚集率的测定

大鼠60只，随机分为6组：NS组，计米丁2.5 μg·kg-1、5.0 μg·kg-1、10.0 μg·kg-1和20.0 μg·kg-1组，以及阳性对照药物 LAS 18.0 mg·kg-1组。大鼠自尾静脉注射受试药物后20 min于麻醉状态下自腹主动脉取血，以3.8 %枸橼酸钠抗凝(血与抗凝剂体积比为9∶1)，以800 r/min离心10 min,取上清即获得富血小板血浆(PRP),剩余血浆经3000 r/min离心10 min，制备贫血小板血浆(PPP)。用PPP调PRP使其含血小板数为3×108·mL-1，以终浓度3 μmol·L-1的ADP为诱导剂，按Born法[13]于血液凝聚仪中测定血小板5 min最大聚集率。以NS组为基准，计算不同给药组血小板聚集抑制百分率。

1.4.3 体外血小板聚集率的测定

大鼠60只，按1.4.2项取血，制备PRP和PPP。用PPP调PRP血小板数至3×108·mL-1，于PRP中分别加入不同浓度受试药物，使其终浓度分别为计米丁6.3 μg·L-1、12.5 μg·L-1、25.0 μg·L-1和50.0 μg·L-1,阳性对照药LAS 40.0 mg·L-1，NS组加入等容量NS。再按1.4.2操作测定血小板5 min最大聚集率。以NS组为基准，计算不同给药组血小板聚集抑制率，并计算计米丁体外抑制血小板聚集的半数抑制浓度IC50。

1.5 统计学方法

2 结 果

2.1 计米丁对大鼠电刺激颈动脉血栓形成的影响

如表1所示，随着计米丁给药剂量的逐渐增大，OT值逐渐延长，且呈良好的量效关系。

表1 静脉注射计米丁对大鼠动脉血栓形成的影响

Tab 1 Effect of germidine (iv) on carotid artery thrombosis in rats

表1 静脉注射计米丁对大鼠动脉血栓形成的影响

1)与NS组相比,P<0.05；2)与NS组相比,P<0.01

组别OT(s)OT延长率(%)NS683.0±28.6-计米丁1.3 μg·kg-1794.9±49.21)16.4计米丁2.5 μg·kg-1869.7±58.72)27.3计米丁5.0 μg·kg-1913.6±32.72)33.8计米丁10.0 μg·kg-1982.9±49.72)43.9计米丁20.0 μg·kg-11133.7±198.52)66.0LAS 18.0 mg·kg-11040.2±53.32)52.3

2.2 计米丁对大鼠体内、外血小板聚集率的影响

如图2所示，NS组、计米丁2.5 μg·kg-1、5.0 μg·kg-1、10.0 μg·kg-1、20.0 μg·kg-1组和LAS 18.0 mg·kg-1组大鼠5 min内血小板最大聚集率分别为(69.9±3.3)%、(54.0±5.4)%、(42.0±5.7)%、(36.7±4.2)%、(25.9±5.1)%和(36.9±4.3)%。与NS组相比，计米丁从小到大剂量组血小板聚集抑制率分别为22.7%、39.9%、47.4%、62.9%(P<0.01)，LAS阳性对照药LAS组血小板聚集抑制率为47.2%(P<0.01)。

如表2所示，随着计米丁终浓度的增大，ADP诱导的大鼠5 min内血小板最大聚集率值逐渐降低，与NS组相比，呈剂量依赖性地抑制ADP诱导的大鼠体外血小板聚集。计米丁终浓度25.0 μg·L-1与LAS 40.0 mg·L-1的作用强度相当。以血小板聚集抑制率的概率单位(Y)对计米丁终浓度的对数(X)作图，得线性回归方程Y=1.26X+3.15(r=0.9980)，计算得计米丁在体外抑制血小板聚集的半数抑制浓度IC50=29.3 μg·L-1。

图2 静脉注射计米丁对大鼠体内血小板聚集的影响

表2 计米丁对大鼠体外血小板聚集的影响

Tab 2 Effect of germidine on ADP induced platelet aggregation in vitro rats

表2 计米丁对大鼠体外血小板聚集的影响

1)与NS组相比，P<0.01；2)与LAS组相比，P>0.05

组别5 min内血小板最大聚集率(%)抑制率(%)NS67.9±3.6-计米丁6.3 μg·L-154.8±4.51)19.4计米丁12.5 μg·L-145.1±3.81)33.6计米丁25.0 μg·L-136.6±4.51)2)46.1计米丁50.0 μg·L-126.3±3.51)61.3LAS 40.0 mg·L-139.3±3.71)42.2

3 讨 论

本实验采用经典的整体动脉血栓形成模型，首次研究了计米丁对实验性动脉血栓形成的影响，并通过体内、外血小板聚集率的测定初步探讨计米丁的抗动脉血栓作用机制。结果表明，大鼠静脉注射计米丁后呈剂量依赖性延长OT，说明计米丁具有抑制动脉血栓形成的作用。

本研究组曾报道，乌苏里藜芦总碱在7.2～42.9 μg·kg-1剂量范围内，其OT延长百分率为9.2%～95.8%；而计米丁在1.3～20.0 μg·kg-1剂量范围内，其OT延长百分率为16.4%～66.0%，提示计米丁可能是总碱中抗动脉血栓形成的一种主要有效成分[6]。

本实验还表明计米丁具有一定的体内、外血小板聚集抑制活性，且呈良好的量效关系。血小板聚集在动脉血栓形成过程中起重要作用，计米丁具有显著的抗血小板聚集的作用，提示可能与其抗动脉血栓形成作用有关。

计米丁为自乌苏里藜芦总碱中提得的一种酯型甾体生物碱，有关其药理作用，未见文献报道。作为一种新型的天然药物，在抗动脉血栓、抗血小板方面，显示了强大的作用，其有效剂量低至μg级水平，计米丁是乌苏里藜芦生物碱中一种重要的抗血栓活性成分，本研究为其作为高效能抗栓药物的开发提供了广阔的前景。其分子药理学作用机制，有待进一步研究。

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