高效液相法快速测定紫金砂中没药烷吉酮和异欧前胡素的含量

王晓梅， 汪鋆植， 郭志勇， 彭元莉， 邹 坤， 但飞君

(天然产物开发与利用湖北省重点实验室(三峡大学)，三峡大学化学与生命科学院，湖北宜昌 443002)

紫金砂来源于伞形科当归属植物拐芹Angelica polymorphaMaxim.的根［1］，为土家族常用药物，为《湖北中药材质量标准》(2009年版)收载品种，具有温中散寒、理气止痛的功效，用于治疗胃痛、腹痛、风湿关节痛等。紫金砂主要含有异欧前胡素﹙isoimperatorin ﹚、欧前胡素［4］(imperatorin)等香豆素成分，没药烷吉酮［6］(Bisabolangelone)等萜类成分［7-9］，还有甾醇类成分［2-3］，挥发油等［5］。其中没药烷吉酮是其主要抗溃疡活性成分［9-10］，欧前胡素和异欧前胡素具有抗菌、抗肿瘤等多种药理作用［13］，欧前胡素主要用于抗菌，抗癫痫等作用［10-12］，本试验对紫金砂中主要成分和主要活性成分异欧前胡素和没药烷吉酮的含量进行了测定。1 材料与仪器

1.1 实验材料、试剂 药材采购于鄂西不同的地区。经中南民族大学万定荣教授鉴定为伞形科植物拐芹Angelica polymorphaMaxim.的根。

甲醇、乙腈(天津市科密欧化学试剂开发中心)。没药烷吉酮对照品(本实验室提供，经HPLC分析其纯度均大于98%)、异欧前胡素对照品(本实验室提供，经HPLC分析其纯度均大于98%)。

1.2 仪器 高效液相色谱仪prostar 210，AL204电子天平，紫外-可见分光光度计 U-3010，KQ3200DB型数控超声波清洗器。

2 实验方法与结果

2.1 色谱条件的优选 分别取紫金砂没药烷基酮和异欧前胡素的对照品和样品经甲醇溶解后，紫外分光光度计进行全波长扫描，图谱显示2个对照品和样品在226 nm处均有最大吸收，故选择226 nm为检测波长。

2.2 色谱条件 色谱柱为YMC-Pack AQ C18，150 mm ×4.6 mm，5 μm;流动相为乙腈-水(40 ∶60 ～70 ∶30);进样量为20 μL，流速为1.0 mL/min;柱温为25℃，检测波长为226 nm。在该色谱条件下待测组分可达到基线分离见下图1。

图1 紫金砂的HPLC图Fig.1 HPLC of Angelica polymorpha Maxim

2.3 对照品溶液制备 精密称取没药烷吉酮和异欧前胡素对照品各10 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释到刻度，0.45 μL滤膜过滤，供测定用。

2.4 供试样品溶液制备 取药材粉碎，过80目筛，精确称取粉末1 g置于锥形瓶中，精密量取甲醇20 mL浸泡2 h，40℃时超声波(40 W)超声提取15 min，放冷，加甲醇至原重量，0.45 μL滤膜过滤，供测定用。

2.5 标准曲线及线性关系考察 精密吸取对照品溶液 1、3、5、7、9 μL 注入液相色谱仪，按色谱条件测得峰面积，以进样量(μL)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。回归方程为:没药烷基酮Y=6.541 49×107X－1.913 47 ×106，r=0.999 81，在1～9 mg/mL呈良好的线性关系。异欧前胡素Y=3.273 98×107X－1.421 15 ×107，r=0.999 93，在1～9 mg/mL呈良好的线性关系。图2和图3为没药烷基酮和异欧前胡素对照品溶液的HPLC图。

图2 对照品没药烷基酮的HPLC图Fig.2 HPLC of bisabolangelone

图3 对照品异欧前胡素的HPLC图Fig.3 HPLC of isoimperatorin

2.6 稳定性试验 取样品溶液，间隔3 h测1次，共测24 h。结果没药烷吉酮峰面积RSD为1.3%(n=8)，异欧前胡素峰面积RSD为1.14%(n=8)表明供试品溶液室温下放置24 h基木稳定。

2.7 精密度实验 精密吸取没药烷吉酮和异欧前胡素对照品溶液6 μL重复进样5次，测定没药烷基酮峰面积的RSD为1.48%，异欧前胡素峰面积的RSD为0.77%

2.8 重复性试验 取样品5份，照2.4项操作，测得没药烷吉酮平均含量为3.8%;异欧前胡素的平均含量为3.1%。

2.9 加样回收试验 精密称取已知含量样品3份，加入与样品含量相当的对照品，测定没药烷吉酮和异欧前胡素含量，计算回收率，结果见表1，表2。

表1 没药烷吉酮加样回收率(n=5)Tab.1 The recoveries of bisabolangelone

2.10 样品含量测定 收集不同产地的5批样品，分别测定药材中没药烷吉酮和异欧前胡素的含量。取药材粉碎，过80目筛，精确称取粉末1 g，精密量取甲醇20 mL浸泡2 h，40℃时超声波(40 W)超声提取15 min，放冷，加甲醇至原重量。0.45 μL滤膜过滤，供测定用。按上述色谱条件，进样测定。结果见表3。

表2 异欧前胡素加样回收率(n=5)Tab.2 The recoveries of isoimperatorin(n=5)

表3 不同产地的紫金砂没药烷基酮和异欧前胡素的质量分数Tab.3 The concentration of bisabolangelone and isoimperatorin of Angelia polymorpha Maxim in different habitats

3 讨论

紫金砂为土家族治疗胃肠疾病的常用药物。本实验从紫金砂主产地鄂西不同的地方收集了具有代表性药材，用HPLC建立了没药烷吉酮和异欧前胡素的含量测定方法。为制定紫金砂的质量标准，进一步控制紫金砂的质量提供了基础。

波长分别取紫金砂没药烷基酮和异欧前胡素的对照品和样品经甲醇溶解后，紫外分光光度计进行全波长扫描，图谱显示2个对照品和样品在226 nm处均有最大吸收，故选择226 nm为检测波长。比较了不同系统和流动相比例，如甲醇-水、乙腈-水-磷酸，甲醇-水-磷酸等，效果都不理想。乙腈-水的比例经调试，结果40∶60～70∶30的比例两者在样品中可以得到较好的分离，且保留时间合适，检测比较快。因此，选择乙腈-水作为流动相。通过正交实验确定其超声时间，药材浸泡的时间，最后得出浸泡2 h，超声15 min，可使紫金砂药材中的2种有效成分含量达到最高。

实验表明没药烷吉酮在紫金砂中含量较高，平均达3.3%，同时没药烷吉酮是紫金砂中抗溃疡的主要有效成分，但不同产地的紫金砂中没药烷吉酮含量差异较大，因此，建立没药烷吉酮的含量测定方法，对紫金砂中没药烷吉酮的含量进行测定，对控制紫金砂的质量具有重要意义。实验表明，以根粗大，油性强，断面挤压有油性物渗出者含量高。

没药烷吉酮、异欧前胡素沸点低，均具有一定挥发性。经过对放置于不同状态，不同时间的紫金砂的含量进行测定，如下表4结果表明，紫金砂存放时间过长或不当，没药烷吉酮、异欧前胡素的含量会下降，影响药效。因此，存储一般不宜超过2年，应密闭保存，避免高温和酸碱。

表4 放置不同时间的紫金砂没药烷基酮和异欧前胡素的质量分数Tab.4 The concentration of bisabolangelone and isoimperatorin of Angelia polymorpha Maxim stored for different periods of time

［1］傅书遐.湖北植物志(3)［M］.武汉:武汉科学技术出版社，2002:237.

［2］米彩峰，李富贤，石会丽.拐芹化学成分研究［J］.西北药学杂志，2003，10(5):207-208.

［3］米彩峰，王长岱，乔博灵，等.拐芹根化学成分研究［J］.药学学报，1995，30(12):910-913.

［4］米彩峰，石惠丽，李富贤.拐芹根化学成分研究Ⅱ［J］.天然产物研究与开发，1997，9(1):43-45.

［5］米彩峰，石惠丽，李富贤，等.拐芹根及根茎中挥发油的成分研究［J］.西北药学杂志，1992，7(2):9-11.

［6］Wang Junzhi，Zou Kun，Cheng Fang，et al.3-Hydroxy-3，6-dimethyl-2-(3-methylbut-2-enylidene)-3，3a，7，7a-tetrahydrobenzofuran-4(2H)-one［J］.Acta Cryst，2007，E63:2706.

［7］Liu Jianghua，Zschocke S，Bauer R.A polyacetylenic acetate and a coumarin fromAngelica pubescensF.biserrata［J］.Phytochem，1998，49(1):211-213.

［8］Novotn L，Samek Z，Sorm F.The structure of bisabolangelone a sesquiterpenic Ketalcohol fromAngelica silvesrtisL.seeds［J］.Tetrahedron Lett，1966，30:3541.

［9］汪鋆植，张荣平，叶 红，等.土家族药紫金砂挥发油成分分析和药理作用研究［J］.中成药，2008，4:596-598.

［10］朱烈彬，汪鋆植，石新兰，等.紫金砂提取物的急性毒性实验［J］.中成药，2008，12:596-598.

［11］Luszczki J J，Glowniak K，Czuczwar S J，et al.Time-course and dose-response relationships of imperatorin in the mouse maximal electroshock seizure threshold model［J］.Neurosci Res，2007，59:18-22.

［12］Choi S Y，Ahn E M，Song M C，et al.In vitro GABA-transaminase inhibitory compounds from the root of Angelica dahurica［J］.Phytother Res，2005，19:839-845.

［13］王洪志，李惠芬，周 静，等.HPLC法测定元胡止痛片中欧前胡素和异欧前胡素［J］. 中草药，2007，38(7):1018-1019.