SPE-HPLC法测定胃肠宁片中3种生物碱的含量

丘明明， 黄玉华

(广西食品药品检验所，广西南宁 530021)

胃肠宁片是在胃肠宁冲剂的基础上改进为片剂，由布渣叶、辣蓼 、番石榴叶、火炭母、功劳木等五味中药经提取加工精制而成，有清热祛湿，健胃止泻功效;用于急性肠胃炎，小儿消化不良。其质量标准收载于卫生部药品标准《中药成方制剂》［1］，无含量测定。处方中功劳木所含有的小檗碱原型生物碱为盐酸药根碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱［2］，目前此类成分都是用甲醇或盐酸－甲醇提取，用中性氧化铝柱进行纯化，再用 HPLC 法进行含量测定［3－11］。经过实验发现该制剂经提取纯化后色谱图杂质峰仍较多，干扰成分峰的测定。本实验采用固相萃取技术，有效地除去杂质干扰，用HPLC同时测定胃肠宁片中盐酸药根碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱3种生物碱的含量，试验结果表明该方法操作简便，准确性、重复性好，可作为该制剂质量控制的方法。

1 仪器与试药

Agilent 1200型高效液相色谱仪(含DAD检测器)，MILLI—Q纯水发生器;梅特勒电子天平;Waters公司WCX型弱阳离子交换SPE小柱(60 mg/3 mL);盐酸小檗碱对照品(批号:110713－200910，供含量测定用，以97.9%计)、盐酸巴马汀对照品(批号:110732－200506，供含量测定用)和盐酸药根碱对照品(批号:0733－200005，供鉴别用，经HPLC法分析，以面积归一化法计算纯度为:98.1%)均为中国药品生物制品检定所提供;胃肠宁片(由广西灵峰药业有限公司提供，批号:080701、081001、091001);阴性对照样品(按照胃肠宁片制备工艺的方法制备缺功劳木的阴性样品，由广西灵峰药业有限公司提供)。乙腈为色谱纯试剂，水为高纯水，其它试剂均为分析纯。

2 方法与结果

图1 阴性样品、对照品、样品HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of negative samples，reference substances and sample

2.1 色谱条件 色谱柱:Hvydro－RP 80A C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，流动相:乙腈－0.05 mol/L 磷酸二氢钠溶液(磷酸调pH2.8)(27:73);流速:1.0 mL/min;检测波长为265 nm;柱温:35℃;进样量10 μL。

2.2 对照品溶液制备 取盐酸药根碱对照品、盐酸巴马汀对照品和盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，制成每1 mL各含0.5 μg的混合溶液，即得。

2.3 供试品溶液制备 取本品10片，除去包衣，精密称定，研细，取约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25%磷酸甲醇溶液25 mL，密塞，称定重量，超声处理(功率400 W，频率40 kHz)30 min，放冷，再称定重量，用25%磷酸甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液1 mL，挥去甲醇，加于WCX型弱阳离子交换小柱(预先依次用甲醇1 mL、水1 mL活化)上，流速约每分钟1 mL，依次用水6 mL、25 mmol/L醋酸钠缓冲液(pH4.5)1 mL洗涤，弃去洗液，抽干1 min，继用甲醇3 mL洗涤，弃去洗液，再用5%甲酸甲醇溶液5 mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣精密加入甲醇2 mL使溶解，摇匀，即得。

2.4 阴性样品溶液制备 取阴性对照样品适量，按2.3项下的方法进行操作，制得阴性样品溶液。

2.5 干扰试验 分别吸取对照品溶液和供试品溶液及阴性样品溶液各10 μL注入液相色谱仪，按上述色谱条件记录色谱图，盐酸药根碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱各峰的保留时间分别为9、15、17 min左右，均与邻近峰达到基线分离，分离度良好(R＞1.5)，阴性对照样品溶液对测定无干扰，结果见图1。

2.6 线性范围的考察 精密称取盐酸药根碱对照品10.97 mg(纯度:98.1%)，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取2 mL置25 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为贮备液。

精密称取盐酸巴马汀对照品11.53 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1 mL置20 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为贮备液。

精密称取盐酸小檗碱对照品10.05 mg(纯度:97.9%)，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取3 mL置50 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为贮备液。

精密量取上述 3 种贮备液 0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 mL，分别置20 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。

按2.1项色谱条件分别进样10 μL，以对照品的进样量(ng)为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归，盐酸药根碱回归方程为:Y=3.890 7X+0.504 2，r=1.000 0;盐酸巴马汀回归方程为:Y=3.749 6X－0.748 0，r=1.000 0;盐酸小檗碱回归方程为:Y=3.905 6X－0.870 0，r=0.999 7。结果表明盐酸药根碱在3.443 7～6.887 4 ng;盐酸巴马汀在2.306～23.060 ng及盐酸小檗碱在2.361 3～23.613 5 ng范围内与峰面积呈良好线性关系。

2.7 精密度试验 取同一份供试品溶液(091001批)，按2.1项色谱条件重复进样6次，记录色谱峰面积，结果盐酸药根碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱RSD分别为0.64%、0.69%、0.76%，表明仪器的精密度良好。

2.8 稳定性试验 取同一份供试品溶液(091001批)，分别于 0、2、4、8、12、18、24 h，按 2.1 项色谱条件，进样测定7次，记录色谱峰面积，结果盐酸药根碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱RSD分别为0.47%、0.90%、0.76%，结果表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.9 重复性试验 取同一批样品(091001批)6份，按2.3项下方法制成供试品溶液，并按2.1项下色谱条件测定，结果盐酸药根碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱含量分别为0.070 73 mg/g、0.055 60 mg/g、0.048 06 mg/g，RSD 分别为 1.17%、0.91%、0.33%。

2.10 加样回收率试验 精密称取已知含量的样品(091001批)，共9份，每份约0.25 g，平均分成3组，分别精密加入一定量的盐酸药根碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱对照品，按2.3项方法操作，并按2.1项下色谱条件测定，计算回收率，结果见表1。

表1加样回收率实验结果Tab.1 Test results of recovery test

2.11 样品测定 取不同批号的样品，按2.3项下 方法制成供试品溶液，并按2.1项下色谱条件测定含量，结果见表2。

表2 样品含量测定结果(n=3)Tab.2 Determination results of samples(n=3)

3 讨论

3.1 波长的选择 用二极管阵列检测器分别对样品溶液和对照品溶液进行检测，结果盐酸药根碱对照品、盐酸巴马汀对照品、盐酸小檗碱对照品分别在265 nm、266 nm和265 nm处有最大吸收，样品峰与对照品一致，故测定波长定为265 nm。

3.2 色谱柱的选择 比较Hvydro－RP 80A C18、Kromasil C18和CAPCELLPAK MGII C183种不同品牌的色谱柱，结果所测成分峰形良好，且与其它成分峰达到基线分离。

3.3 提取条件的选择 (1)比较盐酸－甲醇和磷酸－甲醇溶液提取样品，结果发现两种提取液经过固相萃取小柱后，前者被测成分不被吸附剂吸附，随着杂质流出，而后者被测成分被吸附剂牢牢吸附，与杂质有效分离。(2)比较15%、20%、25%、30%的磷酸甲醇溶液提取样品，结果发现用25%磷酸甲醇溶液提取的含量最高。(3)比较超声处理时间15、30、60 min，结果发现超声处理30 min即能将被测成分提取完全。(4)比较用25%磷酸甲醇溶液15、20、25、50 mL提取样品，结果发现用25 mL即能将被测成分提取完全。

3.4 固相萃取柱的选择 盐酸药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱都是季铵碱，实验中比较了MCX强阳离子交换和WCX弱阳离子交换SPE小柱，这两种SPE小柱对碱性化合物都有强性的保留，能使碱性化合物从酸性和中性杂质中分离出来，但强碱如季铵碱类会不可逆的保留在强阳离子交换柱上，而弱阳离子交换作用则可以洗脱它们，与强阳离子交换柱比较，弱阳离子交换柱上的吸附剂的pKa适用范围更广，从而使洗脱条件的灵活性更大。故选择WCX弱阳离子交换SPE小柱。

3.5 SPE洗脱条件的优化 首先考察上样体积(0.5、1.0、2.0、3.0 mL)，由于样品中含杂质较多，发现上样体积3.0 mL时，溶液无法流出柱子，试验无法进行，说明3.0 mL已经超载。为了确保SPE能处于有效吸附状态，确定过柱体积为1 mL。其次考察洗脱杂质的溶剂水和甲醇的体积(4、5、6、7、8 mL 和1、2、3、4、5 mL)，结果发现用水6 mL 和甲醇3 mL，就能有效地除去杂质。最后考察洗脱被测成分的溶剂5%甲酸甲醇溶液的体积(3、5、8、10 mL)，结果发现洗脱溶剂3 mL～10 mL结果相差都不大，为了洗脱完全又不浪费溶剂，故选择洗脱溶剂体积为5 mL。

［1］卫生部药品标准中药成方制剂［S］.第二册.1990:165.

［2］国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草(第三册)［M］.上海:上海科学技术出版社，1999.

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