大孔吸附树脂纯化芪丹冠心舒微丸提取物工艺研究

张永太， 冯年平， 赵继会， 修彦凤， 陶建生

(上海中医药大学中药学院，上海 201203)

芪丹冠心舒微丸为我校与企业合作开发的六类中药新药，原方中黄芪、丹参、三七三味药材经医用酒精提取，所得提取物得膏率较高，有必要对其进行进一步的纯化研究。目前，大孔吸附树脂已广泛应用于食品及医药工业，在中药有效物质的分离纯化中也有较多应用。本研究即采用大孔树脂，对提取物中有效组分进行分离纯化工艺研究，进一步减小得膏率，富集有效成分，为后续制剂研究扩展空间［1－3］。

1 仪器与材料

高效液相色谱仪(美国Agilent公司，1100型);紫外可见光分光光度计(上海精密科学仪器有限公司，UV754N型);电子天平(德国 SARTORIUS，BP211D型)。

实验所用色谱纯化学试剂与分析纯化学试剂均购自上海国药集团化学试剂有限公司，95%医用酒精购自上海中医药大学设备处，大孔树脂购自上海摩速科学器材有限公司。

化学对照品购自上海市药品检验所，均为中国药品生物制品检定所提供，分别为:丹酚酸B(批号:20070212);黄芪甲苷(批号:20070417);三七皂苷R1(批号:20070509);人参皂苷 Rb1(批号:20070417);人参皂苷Rg1(批号:20070417)。

实验用药材，黄芪(上海养和堂中药饮片有限公司，批号:20061019)、丹参(上海康桥药业有限公司，批号:20071226)、三七 (上海养和堂中药饮片有限公司，批号:20070403)，经我校生药学教研室专家鉴定，均为2010版《中国药典》收载品种［4］。

2 实验内容

2.1 指标性成分检测方法

2.1.1 紫外—可见分光光度法测定总皂苷的含量［5－6］

因黄芪为本复方中君药，用量大，故考虑以黄芪中所含的黄芪甲苷作为指标性成分，考察最大吸收波长。取精制的提取物总皂苷，配成浓度为0.5 mg/mL的溶液。精密吸取0.2 mL，加入香草醛溶液0.2 mL和高氯酸0.8 mL，摇匀，于60℃水浴中放置15 min后，放入冰水浴中冷却2 min，然后加冰醋酸5 mL，进行全波长扫描，其吸收在530～550 nm处达到最大。文献查阅得知黄芪甲苷、三七皂苷类成分的最大吸收波长也在此范围，综合以上因素，决定以530 nm作为本研究测定总皂苷的吸收波长。

取黄芪甲苷对照品10mg，精密称定(10.08 mg)，置10 mL量瓶中，加无水乙醇使溶解并定容。分别精密移取黄芪甲苷标准溶液0.00、0.15、0.30、0.45、0.60、0.75 mL，精密加入香草醛溶液 0.2 mL和高氯酸0.8 mL，摇匀，于60℃水浴中放置15 min后，放入冰水浴中冷却2 min，然后加冰醋酸5 mL。以蒸馏水作为黄芪甲苷标准溶液，同法制备空白对照液，以黄芪甲苷含量对吸光度做直线回归，得回归曲线方程为Y=0.819 1X－0.044 3，相关系数r=0.999，即在黄芪甲苷量为0.075～0.76 mg范围内，黄芪甲苷量与吸光度有良好的线性关系。

2.1.2 高效液相色谱法测定丹酚酸B的含量

采用C18ODS液相色谱柱，以甲醇－乙腈－甲酸－水(30∶10∶1∶59，v/v/v/v)为流动相，流速(1 mL/min)，检测波长为286 nm，柱温30℃。

取丹酚酸对照品，精密称定，以甲醇溶解并定容，制备成0.3(mg/mL)浓度溶液。分别精密移取0.25、0.50、1.00、1.50、2.50、3.75 mL，分别置 5 mL量瓶中，甲醇定容。以浓度对峰面积回归，直线方程为Y=10－4X－0.003 9，相关系数R=0.999，表明在浓度为0.015～0.300 mg/mL浓度范围内，样品浓度与峰面积有良好的线性关系。

2.2 树脂型号考察 分别取 HPD100、HPD300、D101、D201、AB－8 树脂［7－11］各 20 g，预处理后，每种型号树脂平分成2份，即每份10 g，各加入20 mL药液，于振动床(20℃，80 Hz)中振摇2 h，置冰箱中4℃放置12 h，取出装柱，挤干药液，收集药液，用蒸馏水洗脱4次，每次50 mL。分别检测原药液、残留液和蒸馏水洗脱液中总皂苷、丹酚酸B的含量，计算比上柱量与比吸附量，结果见表1。

表1 树脂型号考察

综合比较各树脂的比上柱量和比吸附量，可知除D201型树脂外，其余4种树脂的比上柱量与比吸附量均较高，4种树脂的比上柱量与比吸附量差异较小。虽HPD100型大孔树脂的比上柱量与比吸附量均为最高，但考虑目前医药与食品工业中对AB－8和D101两种型号的树脂应用最普遍，决定选用D101型大孔树脂。

2.3 树脂上样方式考察［12］以比上柱量、比吸附量为考察指标，对动态上样与静态吸附两种上样方法进行比较。计算结果见表2。

表2 树脂上样方式考察

由以上数据分析可知，动态上样总皂苷的比上柱量与比吸附量均高于静态上样，丹酚酸B的比上柱量高于静态上样，比吸附量二者相当。综合以上考察结果，可以得出动态上样为最佳上样方式。

2.4 树脂上样工艺优化 以比上柱量、比吸附量为考察指标，对上样树脂柱的径高比、上样浓度、上样次数进行正交考察，以确定最佳上样工艺。称取D101大孔树脂各10 g，照前法预处理。按L9(3)4表，分别用0.5、0.25、0.125 g生药/mL的药液上样，用蒸馏水洗脱4次，每次50 mL。见表3。

表3 因素水平

分别计算各次实验中总皂苷与丹酚酸B的比上柱量与比吸附量，进行分析。结果见表4与表5。

表4 树脂上样工艺正交优化—总皂苷、丹酚酸B比上柱量与比吸附量综合评分计算结果

由方差分析可得出，因素A对实验结果具有极显著性影响，而因素B和C对实验结果影响均不显著。综合正交分析结果，若以总皂苷与丹酚酸B为考察指标，则最佳上样工艺为A3B2C2，即上样液浓度为0.125(g/mL)，柱径高比为3.64(mm/cm)，上样次数为8次。验证试验表明，优选出的工艺可靠。2.5 洗脱工艺优化 采用L9(3)4正交试验，选择乙醇浓度、乙醇用量与洗脱流速为考察因素，以洗脱百分率与洗脱纯度为考察指标，优化洗脱工艺［13－14］。见表 6 与表 7。

表5树脂上样工艺正交优化—总皂苷与丹酚酸B方差分析

表6 因素水平

分别计算各次实验中总皂苷与丹酚酸B的洗脱百分率与洗脱纯度，分别进行直观分析。结果见表7。

由直观分析可得出，以总皂苷为指标性成分所得最佳洗脱工艺为:以60%浓度乙醇16倍量(倍树脂重，w/w)进行洗脱，流速为0.2倍量(倍树脂重，w/w)/min;以丹酚酸B为指标性成分所得最佳洗脱工艺为:以80%浓度乙醇16倍量(倍树脂重，w/w)进行洗脱，流速为0.2倍量(倍树脂重，w/w)/min。以丹酚酸B和总皂苷作为指标性成分，优化出的最佳洗脱工艺均为乙醇16倍量(倍树脂重，w/w)进行洗脱，流速为0.2倍量(倍树脂重，w/w)/min。因60%乙醇与80%乙醇洗脱丹酚酸B成分的效果相差不大，从节省溶剂成本的角度，宜选用60%浓度的乙醇作为洗脱溶剂。验证试验表明，优选出的工艺可靠。

表7 洗脱条件正交优化—总皂苷与丹酚酸B洗脱百分率与洗脱纯度综合评分计算结果

中试研究结果显示，经过大孔树脂纯化后，所得干浸膏量由原来的60%(干浸膏/药材，w/w)下降到20%，各指标性成分的转移率均在80%以上，达到了预期目的。

3 小结

3.1 对上样方式的考察结果显示，动态吸附效果优于静态吸附。目前生产中多采用静态上样作为上样方法［15］，主要因为其操作比较方便。但经考察发现，本实验中静态上样与动态上样相比，比上柱量与比吸附量均明显小于后者，兼考虑到动态上样虽需在洗脱柱中完成，但其耗时短，无须振荡，且上样后可直接进行后续实验的处理，因此最终确定动态上样方式。

3.2 在对上样方式的考察中，确定在2 h内完成，主要是考虑工作效率和体现动态上样之于静态上样在效率方面的优越性。结果显示，在2 h内动态上样8次则可保证达到最佳吸附效果。

3.3 洗脱工艺的考察中，首先对洗脱溶媒进行单因素考察，制备了洗脱曲线，为采用正交试验考察洗脱工艺中选取因素水平提供参考。实验结果显示，总皂苷与丹酚酸B在乙醇浓度为60%时均可达到较好的解吸效果，且所得固形物中以上两种成分纯度较高。

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