HPLC法测定不同产地傣药肾茶中的迷迭香酸

张丽丽， 敬应春， 彭崇胜， 吴红兵， 邱明丰

(上海交通大学药学院，上海 200240)

HPLC法测定不同产地傣药肾茶中的迷迭香酸

张丽丽， 敬应春， 彭崇胜， 吴红兵， 邱明丰*

(上海交通大学药学院，上海 200240)

目的 建立傣药肾茶中迷迭香酸的测定方法，并测定不同产地肾茶中的迷迭香酸。方法 采用高效液相色谱法，色谱柱 Agilent TC-C18(2)(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相为乙腈-0.1%磷酸(25 ∶75);体积流量 1.0 mL/min;柱温 25℃;检测波长210 nm，图谱采集时间为20 min。结果 迷迭香酸在0.16～1.6 μg(r=1)范围内呈良好线性关系，平均回收率为97.49%，RSD=1.15%(n=9)。结论 该法简便、准确可行，可用于傣药肾茶中迷迭香酸的测定及肾茶的质量控制。

傣药;肾茶;迷迭香酸;高效液相色谱法

傣药肾茶(西双版纳傣医称“芽糯妙”，意译为“猫 须 草”)来 源 于Clerodendranthusspicatus(Thunb.)C.Y.Wu的全草，傣医应用历史长达2000多年，傣医认为其清香，苦，凉。入土、水塔，具有清热解毒、利水通淋之功效，用于膀胱湿热所致的尿急、尿热、尿痛，非特异性下尿路感染见上述症候者［1-2］。肾茶中主要含有迷迭香酸、熊果酸、黄酮类及氨基酸等多种成分［3］。其中迷迭香酸药理活性主要包括抗炎、抗氧化、免疫抑制等，是肾茶主要有效成分之一［4-5］，测定方法主要有分光光度法［6］和高效液相色谱法［7］。目前肾茶饮片［8］和肾茶袋泡茶均无迷迭香酸的测定项目。本实验建立了测定不同产地肾茶中迷迭香酸的高效液相色谱法，为科学控制肾茶质量提供科学依据，为肾茶制剂质量控制提供参考。

1 仪器与试药

Agient 1200型液相色谱仪，G1322A JP7306-7557在线真空脱气机，G1311A DE62968658四元泵，G1329A DE64770852自动进样器，G1316A DE63070860柱温箱，G1315D DE64259927 DAD检测器，ChemStation B.03.01色谱工作站(安捷伦科技有限公司);KQ-250DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);AL204 Mettler Toledo电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)。

迷迭香酸对照品(批号:100415，上海融禾医药科技发展有限公司，纯度大于98%);20个肾茶样品经中国医学科学院药用植物研究所云南分所李学兰研究员鉴定为肾茶Orthosiphonari Status全草，样品编号及来源见表1。乙腈为色谱纯，水为双蒸水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Agilent TC-C18(2)(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相:乙腈-0.1% 磷酸(25 ∶75);体积流量:1.0 mL/min;柱温:25℃;检测波长:210 nm，图谱采集时间为20 min。

表1 样品编号及来源Tab.1 Number and origins of the samples

2.2 对照品溶液的制备 取迷迭香酸对照品约4 mg，精密称定，置25 mL量瓶中加50%甲醇溶解定容，得0.16 mg/mL的对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备 取1～20号肾茶粉末(过4号筛)各约0.36 g，精密称定，置50 mL量瓶中，加50%甲醇超声提取30 min，冷却，定容，摇匀，有机相微孔滤膜(0.45 μm)滤过，备用。

2.4 系统适应性试验 分别将迷迭香酸对照品及供试品溶液10 μL进样高效液相色谱仪，理论塔板数以迷迭香酸峰计算不低于20 000，迷迭香酸峰与周围峰分离度好。对照品及供试品色谱图见图1。

2.5 线性范围考察 分别精密吸取迷迭香酸对照品溶液 1、2、4、6、8、10 μL 进样，采集色谱图，测定峰面积，以峰面积为纵坐标(Y)，以对照品的量(μg)为横坐标(X)，进行回归处理，得回归方程:Y=2 447X－9.474，r=1.000。迷迭香酸在 0.16 ～1.6 μg范围内呈良好线性关系。

2.6 精密度试验 精密吸取对照品溶液，相同色谱条件下重复进样6次，进样量4 μL，结果显示峰面积RSD为0.43%。

2.7 稳定性试验 取20号样品制备供试品溶液，分别在0、2、4、8、12 h精密吸取进样，采集图谱，测定迷迭香酸峰面积，其RSD为1.95%，表明样品中迷迭香酸在12 h内稳定。

图1 迷迭香酸对照品(A)与肾茶供试液(B)色谱Fig.1 HPLC trace of rosmarinic acid(A)and Orthosiphonari Status(B)

2.8 重复性试验 取20号样品按2.3项下制备方法，分别制备6份供试液，同一方法采集图谱，测定迷迭香酸峰面积，并计算其质量分数，其 RSD为0.36%。

2.9 回收率试验 取肾茶粉末(20号)9份，每份约0.18 g，精密称定，分别置50 mL量瓶中，按样品中成分含有量的80%、100%、120%，分别精密加入迷迭香酸对照品溶液(0.16 mg/mL)，再加50%甲醇超声提取 30 min，冷却，定容，摇匀，0.45 μm 微孔滤膜滤过，进样10 μL，采集图谱，根据迷迭香酸峰面积计算(mg)，并计算回收率(%)，结果见表2。

2.10 样品测定 将收集的肾茶按2.3项下方法制成供试品溶液，同样色谱条件下进样(n=3)，采集图谱，测定结果见表3。不同产地肾茶中迷迭香酸比较见表4。

表2 迷迭香酸的回收率试验结果Tab.2 Recovery of rosmarinic acid

表3 肾茶中迷迭香酸的测定结果Tab.3 Content of rosmarinic acid

4 讨论

4.1 样品处理方法的选择 考察了甲醇、水、25%甲醇、50%甲醇、75%甲醇等不同提取溶剂，结果表明50%甲醇提取样品HPLC图谱杂峰数目少、迷迭香酸峰面积大，提取效果最好，所以选择50%甲醇作为提取溶剂。比较了超声波振荡提取(15、30、45 min)和水浴加热回流提取(2 h)两种提取方法，结果显示超声15 min所得图谱峰数目比较少，其他方法所得HPLC图谱中峰数目以及各峰峰面积没有明显差别，考虑到超声波振荡提取法简便易行，所以选择超声波振荡提取(30 min)制备供试品溶液。

表4 不同产地肾茶中迷迭香酸比较Tab.4 Content of rosmarinic acid in Orthosiphonari Status from different habitats

4.2 色谱条件的选择 本实验所用色谱条件是在大量摸索试验以及参考文献［9-12］的基础上不断优化筛选而确定的。曾以甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.1%甲酸作为流动相进行洗脱，以乙腈-0.1%磷酸为流动相得到图谱分离效果最好，故选定乙腈-0.1%磷酸作为流动相。

4.3 测定结果 不同产地肾茶中的迷迭香酸量相差较大，云南肾茶最高，浙江、福建和海南三省肾茶居次，老挝、广东和广西较低。从迷迭香酸具有抗炎、抗氧化、免疫抑制等药理活性角度看，在发挥肾茶这些方面作用时宜选则云南肾茶较佳。

致谢:肾茶样品采集与鉴定得到了中国医学科学院药用植物研究所、西双版纳傣族自治州傣医医院(民族医药研究所)及相关单位和友人的大力支持与帮助。

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Determination of rosmarinic acid inDaiMedicine-Orthosiphonari Status(Shencha)from different habitats by HPLC

ZHANG Li-li， JING Ying-chun， PENG Chong-sheng， WU Hong-bing， QIU Ming-feng*

(School of Pharmacy，Shanghai Jiao Tong University，Shanghai，200240)

DaiMedicine;Orthosiphonari Status(Shencha);rosmarinic acid;HPLC

2011-11-16

云南省科技厅项目(2008IF018，2009BC014);上海市科委项目(08DZ1971303)

张丽丽(1985—)，女，硕士生，从事中药新制剂研究，Tel:(021)34205051，E-mail:susan.lilizh1224@163.com

*通信作者:邱明丰(1970—)，男，副教授，从事中药新制剂与新剂型研究。Tel:(021)34204052，E-mail:mfqiu@sjtu.edu.cn

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R284.1

A

1001-1528(2011)08-1378-04