丹参、红花分提和合提提取液的指纹图谱比较

王小平，刘 峰，韩 翠，马存德

(1．陕西中医学院，陕西 咸阳 712046;2．陕西步长制药有限公司，陕西 咸阳 712000)

中药复方制剂在提取过程中，由于各药味的化学成分相互影响，产生助溶、化学反应等现象，使中药复方制剂中提取的有效成分发生变化，直接影响中药复方制剂的临床疗效。因此，研究中药复方制剂有效成分的变化是中药复方研究的一个重要内容[1]。丹红注射液 (国药准字Z20026866)具有活血化瘀、通脉舒络功能，用于瘀血闭阻所致的胸痹及中风、冠心病、心绞痛，心肌梗塞等症。复方配伍由于药物间的相互作用使得化学成分更加复杂多变，用某一种或几种化学成分的含量难以全面评价复方的制备工艺，而指纹图谱在中药或中成药的研究和应用越来越广泛[2－4]。因此，笔者采用指纹图谱技术，分析、比较丹参和红花分提和合提两种提取液，探讨两药不同提取方法所得提取液化学组成成分的差异。旨在为丹红注射液的工艺改进提供理论依据。

1 仪器、试药与材料

1.1 仪器与材料

戴安UitiMate 3000全自动高效液相色谱仪，泵:UitiMate 3000;自动进样器:UitiMate 3000;检测器:UitiMate 3000UV检测器。工作站:Chromeleon。UV756紫外可见分光光度计 (上海精密科学仪器有限公司)。Discovery DV215CD型双量程电子分析天平 (瑞士;0.01mg;0.1mg)

1.2 试药

羟基红花黄色素A(111637－200503)、丹参素钠对照品 (110855－200405)、丹酚酸B对照品(111562－200807)均由中国药品生物制品检定所提供。原儿茶醛均由北京大学医学部中药现代化研究中心提供。流动相所用甲醇、乙腈为色谱醇，其他试剂如:磷酸等均为分析纯;丹参、红花来自山东菏泽步长制药有限公司。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:迪马公司Diamonsil(钻石)C18色谱柱 (4.6mm×250mm，5μm);流动相:甲醇－乙腈－0.4%的磷酸水，梯度洗脱;流速:1.0mL/min，检测波长:377 nm，柱温:25℃;进样量:15μL。

2.2 对照品溶液的制备

分别精密称取羟基红花黄色素A、丹参素钠、丹酚酸B、原儿茶醛对照品适量，用甲醇溶解并稀释，制成每1mL溶液含羟基红花黄色素A、丹参素钠、丹酚酸B、原儿茶醛分别为0.2mg．

表1 梯度变化表

2.3 供试品溶液的制备

2.3.1 丹参和红花合提

取丹参药材饮片3份:红花药材1份(为丹红注射液处方组成的比例)，两药合并，加水10倍量，提取3次，每次0.5h，过滤，合并滤液，备用。

2.3.2 丹参、红花分别提取

取与“2.3.1”项下相同量的药材，分别加水10倍量，提取3次，每次0.5h，过滤，滤液合并，备用。

2.4 精密度试验

取同一份供试品溶液，连续进样5次，用MATLAB软件计算相似度，在同一仪器测得的色谱指纹图谱与其所得共有模式图谱的相似度分别为0.9925，0.9956，0.9943，0.9928，0.9964，满足相似度不小于0.950，并考察色谱峰保留时间和峰面积的一致性，羟基红花黄色素A、丹参素钠、丹酚酸B、原儿茶醛保留时间RSD和峰面积的RSD均小于1.9%．

2.5 稳定性试验

取供试品溶液，分别于0，1.5，3，6，8，12 h进样检测，直观观察指纹图谱的全貌无明显变化，用MATLAB软件计算相似度，在同一仪器测得的色谱指纹图谱与其所得共有模式图谱的相似度分别为0.9971，0.9948，0.9906，0.9925，0.9916，满足相似度不小于0.950，并考察保留时间和峰面积的一致性，羟基红花黄色素A、丹参素钠、丹酚酸B、原儿茶醛保留时间RSD和峰面积的RSD均小于1.8%，表明在此时间内供试品溶液中的上述成分是稳定的。

2.6 重复性试验

分别取同一丹参药材饮片、红花药材样品6份，制备供试品溶液，分别注入液相色谱仪测定，所得色谱指纹图谱直观观察，表明指纹图谱的全貌无明显变化，用MATLAB软件计算相似度，在同一仪器测得的色谱指纹图谱与其所得共有模式图谱的 相 似 度 分 别 为 0.9927，0.9935，0.9956，0.9918，0.9938，0.9959，均大于0.95，并考察保留时间和峰面积的一致性，羟基红花黄色素A、丹参素钠、丹酚酸B、原儿茶醛保留时间RSD和峰面积的RSD均小于1.9%．

2.7 样品测定

分别精密吸取上述供试品溶液适量，置10mL量瓶中，用水稀释到刻度，摇匀，经0.45μm微孔滤膜滤过，精密吸取10μL注入液相色谱仪，测定，记录色谱图。对不同批次HPLC色谱图进行解析，确定共有峰，构建样品的HPLC色谱图的指纹特征。采用MATLAB软件对各样品色谱图的原始数据进行分析，以6批样品生成的对照谱图作为对照模版，计算各色谱图的整体相似度，6批样品相似度分别为 0.9905，0.9934，0.9897，0.9934，0.9964，0.9985。精密吸取羟基红花黄色素A、丹参素钠、丹酚酸B、原儿茶醛对照品溶液与供试品溶液各10uL，分别进样测定，确定指纹色谱图中的6号峰为羟基红花黄色素A，9号峰为丹参素，10号峰为原儿茶醛，14号峰为丹酚酸B。

2.8 结果

丹参和红花不同提取方法所得提取液共有模式指纹图谱见图1。从整体角度判断，以两药合提所得提取液指纹图谱中的主要色谱峰为基准，与两药分别提取再合并所得提取液的图谱做比较，发现两药分提与合提的指纹图谱中主要色谱峰数目一致，保留时间基本相同，峰面积基本相等。初步断定丹参、红花分提与合提，其主要化学成分没有发生变化。

3 讨论

采用UV检测器对指纹图谱的检测波长进行选择，结果表明，检测波长377nm处，所得各色谱峰具有代表性，信息量较大，各色谱分离度好。故选用377nm为检测波长。采用不同的洗脱系统对流动相的组成进行优化，最终选用2.1项下的流动相组成进行梯度洗脱，各色谱分离度好，基线平稳。本文比较了Kromasil C18100－5(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱和迪马公司 Diamonsil(钻石)C18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱，从指纹图谱整体信息比较来看，Kromasil柱所得图谱和Diamonsil柱所得图谱的差异不大，色谱的整体性相似。从戴安UitiMate 3000高效液相色谱仪和美国Agilent－1100型高效液相色谱仪所得指纹图谱的整体性和模糊性上来看，整体信息基本相似，说明指纹图谱在不同仪器上的“相似性”。故本文的HPLC指纹图谱在不同型号仪器和不同色谱柱上具有良好的重现性。

图1 丹参红花合提和分提所得提取液共有模式图谱

从本实验结果可以看出，丹参、红花 (按3∶1的比例)两药分别提取后，再将提取液合并与两药合提的主要化学成分的种类和峰面积基本一致。这说明丹参、红花两药分别提取后，将提取液合并与两药合提对主要化学成分的种类和含量几乎没有影响。

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