RhoA参与缓激肽调节紧密连接相关蛋白occludin分布和表达的作用

马 腾，王 萍，薛一雪

(中国医科大学基础医学院神经生物学教研室，沈阳110001)

研究显示，化疗药物进入脑胶质瘤组织必须通过血肿瘤屏障(BTB)，BTB在很大程度上影响其化疗效果［1］;肿瘤组织的化疗药物浓度提高2倍，其疗效增加10倍，增加脑胶质瘤组织中的化疗药物浓度是提高其疗效的重要因素。国内外研究表明，小剂量缓激肽(BK)及其受体激动剂RMP-7能增加BTB通透性，两者的作用及机制基本相似。目前，对BK及其受体激动剂增加BTB通透性的机制仍不明确。研究证明［2］，BK可降低脑微血管内皮细胞(RBMECs)膜上的紧密连接相关蛋白occludin表达，通过开放紧密连接(TJ)的细胞旁途径开放BTB，但其具体机制不明。RhoA/ROCK 信号通路参与许多血管活性物质介导的内皮细胞通透性升高过程［3］。以往研究证明，ROCK参与BK介导的BTB通透性增加［4］。为探讨RhoA参与BK对occludin分布和表达的调节作用，2009年3月～2010年3月，我们进行了相关研究。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂 Nuserum血清(BD Biosciences);FBS(Hyclone公司);occludin抗体(Zymed);RhoA特异性抑制剂肉毒梭菌C3胞外酶、DMEM培养液、BK(Sigma)。

1.2 实验方法

1.2.1 RBMECs原代培养和体外BTB建模 将48只3～5 d的胚胎大鼠用CO2吸入法处死，开颅取其大脑皮质。分离培养大鼠RBMECs及体外BTB建模方法参考文献［2，5］。将大鼠分为6组各8只，即对照组、BK 0 min组(A 组)、BK 5 min组(B 组)、BK 10 min组(C组)、BK 15 min组(D组)和BK 15 min+C3胞外酶组(E组)。对照组加等量无菌生理盐水1 μmol/L 处理 15 min;A、B、C、D 组分别在不同时间加BK处理;E组将C3胞外酶50 μg/ml加入Transwell上室中，4 h后移去上室培养基，向上室加BK 1 μmol/L 作用15 min。

1.2.2 跨内皮细胞电阻抗(TEER)检测 应用Millicell-ERS电阻测量系统，检测各组体外 BTB的TEER。

1.2.3 Western-blot法检测occludin表达 当Transwell上室的细胞生长到融合时，先用PBS冲洗，再用细胞铲刮取下，倒入裂解液A 1 ml中，匀浆、离心，上清液为蛋白样品液。抗 occludin抗体(1∶600)、抗 β-actin 抗体(1∶1 000)4 ℃孵育、二抗孵育、发光、显像，所得图像进行定量分析，测量整合光密度值(IDV)。

1.2.4 免疫荧光法观察 occludin分布 将单层RBMECs用冷冰固定，0.5%TritonX-100透化，5%BSA封闭。occludin(1∶200)孵育后，用荧光二抗(1∶200)避光孵育，封片，观察，采集图像。

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件，两组数据比较用t检验，多组间比较用Bonferroni检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组TEER值比较 见图1。

图1 各组TEER值比较

2.2 各组occludin表达比较 见图2。

图2 各组occludin表达比较

2.3 occludin分布 A组occludin在RBMECs膜上呈连续分布;B组occludin在细胞膜上不连续分布，且表达减少，occludin由细胞膜向细胞质转移;E组occludin部分恢复呈连续分布，occludin由细胞膜向细胞质的转移明显减少。

3 讨论

我们以往研究发现，BK可明显降低TEER，增加体外BTB模型的通透性，与Liu等［2］报道一致。本研究显示，C3胞外酶可抑制体外BTB模型TEER降低，证明RhoA信号分子参与BK介导的BTB开放。

Occludin是构成TJ的主要跨膜蛋白，TJ是构成BTB的重要结构。细胞膜上的occludin蛋白表达减少时，提示TJ开放，BTB通透性增加。本研究发现，BK可明显降低细胞膜上的occludin表达，C3胞外酶可明显抑制其表达下降，说明RhoA信号分子参与BK介导的BTB通透性增加;还发现BK可使occludin重新分布，C3胞外酶可抑制BK使occludin重分布的作用。Russ等［6］研究表明，RhoA信号分子可诱导应力纤维形成，引起occludin重新分布，增加内皮细胞的通透性。本研究结果与文献报道［6］一致，说明BK也能引起occludin重新分布，使BTB开放;但C3胞外酶不能完全抑制BK的效应，提示可能有其他信号传导通路参与BK开放BTB的过程。

综上所述，RhoA信号分子参与BK对occludin的分布和表达调节，以及BTB通透性升高过程;但是否有其他信号传导通路参与此过程调节仍不明确，有待于深入研究。

［1］Erdlenbruch B，Schinkhof C，Kugler W，et al.Intracarotid administration of short-chain alkylglycerols for increased delivery of methotrexate to the rat brain［J］.Br J Pharmacol，2003，139(4):685-694.

［2］Liu LB，Xue YX，Liu YH，et al.Bradykinin increases blood-tumor barrier permeability by down-regulating the expression levels of ZO-1，occludin，and claudin-5 and rearranging actin cytoskeleton［J］.J Neurosci Res，2008，86(5):1153-1168.

［3］Sun H，Breslin JW，Zhu J，et al.RhoA and ROCK signaling in VEGF-induced microvascular endothelial hyperpermeability［J］.Microcirculation，2006，13(3):237-247.

［4］马腾，薛一雪.Y-27632抑制缓激肽选择开放血肿瘤屏障的研究［J］.解剖科学进展，2009，15(4):400-402.

［5］Fan L，Liu Y，Ying H，et al.Increasing of blood-tumor barrier permeability through paracellular pathway by low-frequency ultrasound irradiation in vitro［J］.J Mol Neurosci，2011，43(3):541-548.

［6］Russ PK，Kupperman AI，Presley SH，et al.Inhibition of RhoA signaling with increased Bves in trabecular meshwork cells［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2010，51(1):223-230.