RP-HPLC法测定清肺抑火丸中芒果苷的含量

张丽珍，周之荣（广东药学院，广州市 510006）

清肺抑火丸是由黄芩、栀子、知母、浙贝母、黄柏等10味药材制成的中药成方制剂，具有清肺止咳、化痰通便之功效。临床用于治疗痰热阻肺所致的咳嗽、痰黄稠黏、口干咽痛、大便干燥。该产品现行标准[1]采用高效液相色谱（HPLC）法测定黄芩苷的含量，有文献报道薄层扫描法测定清肺抑火丸中小檗碱和菝葜皂苷元的含量[2]和HPLC法测定白花前胡甲素[3]及大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚4种蒽醌类成分的含量[4]，但芒果苷的含量测定未见文献报道。为进一步评价该制剂的质量，笔者建立了清肺抑火丸中芒果苷含量测定的反相高效液相色谱（RP-HPLC）法，并证明该法具有分离效果好、灵敏、准确等优点，可用于清肺抑火丸的质量控制。

1 仪器与试药

Agilent 1100 HPLC仪、Agilent 1100系列双元泵、Agilent 1100可变波长检测器、Agilent 1100/化学工作站（美国安捷伦公司）；KQ-400KDB型高功率数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，工作频率100 kHz，输出功率400 W）。

芒果苷对照品（中国药品生物制品检定所，批号：111607-200402）；清肺抑火丸（甘肃佛仁制药科技有限公司，批号：20100702、20100901、20100704、20100501、20090504，规格：每袋6 g）；乙腈为色谱纯，水为双蒸水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取芒果苷对照品10.2 mg，置于100 mL容量瓶中，加稀乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液（芒果苷浓度为102 μg·mL－1）。

2.1.2 供试品溶液的制备 取清肺抑火丸适量，研细，取约0.5 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇25 mL，称定重量，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，弃去初滤液，续滤液0.45 μm滤膜过滤，作为供试品溶液。

2.1.3 阴性对照溶液的制备 取处方组成中除知母外的其余成分，制成不含知母的阴性对照，按“2.1.2”项下的制备方法处理，作为阴性对照溶液。

2.2 色谱条件及系统适用性试验

色谱柱：Diamonsil-C18柱（250 mm×4.6 mm，5µm，美国迪马公司）；流动相：乙腈-0.2%磷酸水溶液（13∶87）；流速：1.0 mL·min－1；检测波长：258 nm；进样量：10 µL；柱温：35 ℃。分别取对照品溶液（芒果苷浓度为25.5µg·mL－1）、供试品溶液和阴性对照溶液10µL，注入HPLC仪。结果，理论板数以芒果苷峰计算≥6000；芒果苷峰的拖尾因子为0.95，保留时间约为16.5 min，芒果苷峰与其他组分峰的分离度＞1.5；阴性对照不干扰样品测定。色谱见图1。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察 分别吸取0.5、1.0、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0 mL的芒果苷对照品贮备液，加稀乙醇稀释成芒果苷浓度为5.1、10.2、20.4、25.5、30.6、40.8、51.0 µg·mL－1的溶液。依次进样10µL，每个浓度测定3次以上。以峰面积（A）对对照品溶液系列浓度（C）进行回归，得回归方程A＝42.11C－16.06（r＝0.9997）。结果表明，芒果苷检测浓度在5.1～51.0 µg·mL－1范围内与峰面积积分值线性关系良好。

2.3.2 精密度试验 取浓度为25.5µg·mL－1的芒果苷对照品溶液10µL，连续测定5次。结果，其峰面积的平均值为1074.0，RSD＝0.39%，表明仪器精密度良好。

2.3.3 稳定性试验 取供试品溶液（批号：20100702）于0、2、4、6、8、12 h 分别进样10 µL，记录峰面积。结果，芒果苷峰面积的平均值为956.0，RSD＝1.47%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.3.4 重复性试验 取同一批号（20100702）样品适量，共6份，按“2.1.2”方法提取、“2.2”项下方法测定。结果，芒果苷平均含量为1.170 mg·g－1，RSD＝0.54%，表明本方法重复性良好。

2.3.5 加样回收率试验 精密称取同一批号（20100702）样品适量，共6份，加入相应量的芒果苷对照品，照“2.1.2”方法处理并按照“2.2”项下方法测定，计算回收率。结果，芒果苷平均加样回收率为99.6%，RSD＝1.33%，详见表1。

表1 加样回收率试验结果（n＝6）Tab 1 Results of recovery tset（n＝6）

2.4 样品含量测定

取清肺抑火丸样品5批，照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取对照品溶液（25.5µg·mL－1）与供试品溶液各10µL，注入HPLC仪，按照“2.2”项下方法测定，计算样品中芒果苷的含量，结果见表2。

表2 样品含量测定结果Tab 2 Results of content determination of samples

3 讨论

知母是百合科植物知母的干燥根茎，为2010年版《中国药典》收载的常用中药之一，味甘、苦，性寒，入肺、胃、肾经，具有清热泻火、生津润燥之功，为方中主药。其化学成分主要有甾体皂苷、双苯吡酮类、木脂素类、有机酸类、生物碱、黄酮类、多糖类、微量元素及大量的黏液质等[5]，其中芒果苷是知母中主要的双苯吡酮类成分，含量可达0.7%[6]，具有抗炎和减轻哮踹作用、抗病毒和抗肿瘤作用、抗氧化作用、免疫调节作用[7]，因此笔者将芒果苷作为清肺抑火丸含量测定的指标性成分。

本试验曾考察了不同的提取溶剂（甲醇、乙醇、三氯甲烷）、不同提取方法（回流、超声）、不同的超声提取时间（20、30、40、50、60 min）对芒果苷含量的影响。结果表明，稀乙醇超声提取30 min，直接过滤制备的供试品溶液，芒果苷的提取率高、分离效果好。

芒果苷具有一定的弱酸性。试验中考察了不同比例的乙腈-磷酸水溶液对分离的影响，结果发现乙腈-磷酸水溶液（13∶87）为流动相，能实现芒果苷与其他组分的有效分离，芒果苷峰形好，分离度＞1.5。试验还发现柱温对芒果苷分离测定影响较大，在室温下测定结果不稳定，当柱温选择35℃时，得到满意结果。因此，选用如前所述的色谱条件。

综上所述，本试验采用RP-HPLC法中的离子抑制色谱法测定芒果苷的含量，方法学验证表明，其精密度、稳定性、加样回收率和重复性均能满足定量的要求。故本方法可用于清肺抑火丸的质量控制，建议相关标准升级时增加芒果苷的含量测定。

[1]国家药典委员会编.中华人民共和国药典（一部）[S].2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：1116.

[2]卫恒巧，李作平，崔秀彦，等.薄层扫描法测定清肺抑火丸中小檗碱和菝葜皂苷元的含量[J].河北医科大学学报，1992，（4）：199.

[3]黄瑞红，杨慧文.RP-HPLC法测定清肺抑火丸中白花前胡甲素的含量[J].中国药房，2010，21（27）：2556.

[4]叶秀金，宋粉云.HP LC法测定清肺抑火丸中大黄的四种成分的含量 [J].中药新药与临床药理，2010，21（6）：646.

[5]李习平，石继连，胡还甫.知母的研究概况[J].岳阳职业技术学院学报，2010，25（1）：90.

[6]杨丽荣.知母的化学成分及药理作用研究进展[J].国外医学中医中药分册，2002，24（4）：207.

[7]王颖异，郭宝林，张立军.知母化学成分的药理研究进展[J].科技导报，2010，28（12）：110.