菩人丹超微粉对糖尿病大鼠视网膜VEGF蛋白表达的影响Δ

王海彬，王东华，张铁民（承德医学院附属医院眼科，承德市 067000）

糖尿病视网膜病变（Diabetic retinopathy，DR）是糖尿病微血管病变在眼部的重要并发症[1]。从中医学角度讲，其发病辨证为阴虚为本、血瘀为标，治以益气养阴、活血化瘀类中药，临床上可取得较好效果。本课题组利用糖尿病模型大鼠的视网膜石蜡切片进行免疫组化研究，观察了血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）蛋白在不同组别的表达情况，旨在研究菩人丹超微粉在早期DR治疗中的作用。

1 仪器与材料

1.1 仪器

E600型光学显微镜（日本尼康公司）；ONE TOUCH血糖仪（强生（中国）有限公司）。

1.2 试药

人参、丹参、制何首乌、葛根、水蛭均由河北省承德医学院附属医院中药房提供，由河北省承德医学院附属医院王东华主任药师鉴定为真品；链脲佐菌素（STZ，美国Sigma公司）；苦瓜由笔者购买。

1.3 动物

健康Wistar大鼠60只，♂，体重150～200 g，由中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心提供（动物生产许可证号：SCXK（津）2005-0001）。

2 方法

2.1 复制模型

将STZ溶于0.05 mol·L-1柠檬酸缓冲液（pH 4.5），制备成浓度为1.25%的溶液，随机选取50只大鼠，ip STZ 60 mg·kg-1以诱发糖尿病，另外10只作为正常组，仅ip同样体积的柠檬酸缓冲液，注射3 d后用血糖仪测血糖，用尿糖试纸测尿糖浓度，以血糖＞16.5 mmol·L-1、尿糖（++++）、尿量以及饮水明显增多者作为实验对象。

2.2 菩人丹超微粉的组方和制备工艺

2.2.1 组方 苦瓜原汁10 kg，人参1 kg，丹参3 kg，制何首乌1 kg，葛根1 kg，水蛭0.3 kg。

2.2.2 制备工艺 苦瓜原汁10 kg，过滤，减压浓缩到0.6 kg；人参、丹参，粗碎成5 mm左右颗粒，加10倍水回流提取3次，时间为2、1.5、1 h，浓缩；葛根、制首乌加10倍量70%乙醇回流提取2次，时间为1.5、1 h，浓缩；水蛭加10倍量90%乙醇回流提取2次，时间为2、1.5 h（提取温度控制在60℃），浓缩。合并上述提取液，喷雾干燥，即得。共提取超微粉2.0 kg。

2.3 分组和给药

实验分为3组，即正常（等容生理盐水）、模型（等容生理盐水）、菩人丹超微粉（15 mL·kg-1）组，ig给药，每天1次，连续5个月，定期测血糖、尿糖和体重。5个月后轻摘眼球，留做实验。

2.4 取材、固定和石蜡切片制作

ig 5个月后断颈处死大鼠，处死后立即取出眼球，固定于10%福尔马林中，48 h后常规石蜡包埋，连续4 μm切片用于免疫组化染色和HE染色。

2.5 免疫组化染色

通过脱蜡、脱水，组织修复、滴加抗体，复染，封片等完成免疫组化染色，其中抗体浓度为1∶200。

2.6 结果的测定

利用血糖仪分别测量在复制模型成功时和1个月、3个月、5个月时的各组大鼠血糖值。采用光学显微镜及其照相系统，对结果进行观察并照相进行比较。

2.7 统计学方法

3 结果

3.1 免疫组化结果

正常组VEGF的免疫组化无阳性表达，视神经感觉层各层均未见到明显染色。模型组VEGF的免疫组化出现阳性的表达，外界膜、外丛状层、内核层、内丛状层以及视神经节细胞层均出现极棕色的染色，且染色的程度较实验组强，面积较正常组大，外核层靠近外界膜处也出现染色现象；内核层细胞间隙增大，细胞水肿明显，细胞形态改变。菩人丹超微粉组VEGF的免疫组化出现弱阳性改变。免疫组化图见图1；菩人丹超微粉对于糖尿病模型大鼠视网膜病变中VEGF蛋白表达的影响见表1。

图1 免疫组化图片A.正常组；B.模型组；C.菩人丹超微粉组Fig 1 Immunol histochemistry picturesA.normal group；B.model group；C.Purendan ultrafine powder group

3.2 不同时间点血糖值测定结果

表1 菩人丹超微粉对糖尿病模型大鼠视网膜病变中VEGF蛋白表达的影响Tab 1 Effects of Purendan ultrafine powder on the expression of VEGF in retina of diabetic rats

正常组血糖正常；模型组血糖显著升高（P＜0.01）；菩人丹超微粉组血糖值显著降低（P＜0.01）。菩人丹超微粉对糖尿病大鼠不同时间点血糖值的影响见表2。

表2 菩人丹超微粉对糖尿病大鼠不同时间点血糖值的影响Tab 2 Effects of Purendan ultrafine powder on the level of blood glucose in diabetic rats at different time points

4 讨论

现代研究证明，VEGF在DR的发生、发展及转归中起着重要的作用[2，3]。视网膜上多种细胞均可以产生VEGF，作用于血管后促进其内皮细胞分裂，最终形成新生血管；VEGF使微血管内皮细胞通透性增强，大分子物质如纤维蛋白原等进入细胞外基质中形成纤维蛋白凝胶[4]，减慢血流速度增加血液黏稠度，增加血管堵塞的几率。VEGF与DR之间存在着正相关的关系[5]。因此，通过观察视网膜组织中的VEGF染色情况可以反过来判断疾病的发病程度以及用药治疗后的疗效。

本研究结果表明，在5个月观察时，菩人丹超微粉组大鼠的视网膜病理切片免疫组化染色较模型组明显要弱，从微观上证明中药菩人丹超微粉在治疗DR上确实是有效的。

ig给药5个月后，内核层的染色相对于外核层次无论在治疗组还是对照组均较强，究其原因笔者认为是该层主要由双极细胞、Müller等的细胞核构成，在DR时这一层可以通过自分泌或旁分泌产生大量VEGF[6]，从而出现以上结果，这与曾凯宏等[7]的研究结果是一致的；对照组外核层也出现了VEGF的显色，可能是由于神经细胞在视网膜中的耗氧量最大，因此对缺氧相对更敏感造成的[8]。

DR属中医“内障”的范畴，很多医家认为其病因病机是先天禀赋不足，后天调养失调，导致肝肾阴虚、阴亏燥热、耗精灼液、血稠成瘀、脉络不通、精气不能上荣于目而致，气阴亏虚是本，气滞血瘀是标，以“滋阴清热、活血通络”之法治之[9]。中药菩人丹以人参、丹参、葛根益气生津和活血化瘀；苦瓜清解郁热；制何首乌补益精血、固肾益阴；水蛭祛瘀消、剔邪搜络。诸药协同有益气养阴、调畅气血、化瘀通络之功。

现代药理研究表明，人参含有多种化学成分，主要有人参皂苷、人参多糖、多肽、人参炔醇、麦芽酚、腺嘌呤核苷以及某些氨基酸和微量元素等，具有降低血糖、减轻体重、调节血脂、改善凝血功能等功能[10，11]。苦瓜含有三萜类-苦瓜皂苷、甾类-苦瓜苷等，具有降低血糖，抗氧自由基抑制β细胞凋亡作用[12]。丹参通过抗氧化作用抵抗自由基造成的内皮细胞损伤，增加超氧化物歧化酶（SOD）活性，下调丙二醛（MDA）含量从而对血管内皮起到保护作用[13]。葛根对具有改善血管内皮功能作用和改善微循环的作用[14]。近年的许多研究发现，水蛭及其唾液中含有多种活性成分，包括水蛭素、组胺样物质、蛋白质、抗血栓素等。水蛭素有拮抗凝血酶强抗凝作用，也可抑制凝血酶对内皮细胞刺激诱导血管生成的作用，是凝血酶的特异性抑制剂[15]。诸药合用具有降血糖，促使胰岛细胞的恢复，保护血管内皮，防止血栓形成和抗氧化，改善视网膜微循环，改善视网膜缺氧状态的作用。

本研究证实，VEGF在糖尿病大鼠模型的视网膜中确实出现了阳性的表达，而且各个层次表达不一。中药菩人丹超微粉可以有效抑制其表达，从而起到延缓或治疗DR的作用，并证实了该中药的有效性，可为临床进一步研究奠定理论基础。

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