海康灵各组分抗神经细胞损伤有效部位和有效剂量的研究Δ

郭素，刘洪玲，孙伟，孙向红#（1.青岛大学，青岛市 66003；.青岛大学医学院附属医院，青岛市 66003）

海康灵合剂是在中医理论指导下，在医院协定处方“扶正液”基础上加减药味而成的临床上治疗阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）的有效方剂。前期药效学研究结果表明，海康灵对东莨菪碱所致AD模型动物学习记忆功能具有明显的改善作用，其作用与抗氧化作用有关。为进一步研究其作用机制，笔者进行了拆方研究，通过拆方观察比较新复方与原复方、新复方与单味药对损伤神经细胞的影响，筛选出更为理想的量效关系，从而优化处方。

1 仪器与材料

1.1 仪器

倒置相差显微镜（日本Nikon公司）；Model550型酶标仪（美国BioRad公司）；KJWK-Ⅲ型微电脑净化工作台（青岛康净净化消毒设备有限公司）；细胞培养箱（德国Heraeus公司）；生物安全柜（海尔集团特种电器有限公司）；80-2型离心沉淀器（金坛市国旺实验仪器厂）。

1.2 试药

海康灵，主要含有制何首乌、黄芪、党参、灵芝、红景天、川芎、当归，生药含量为1374 g·L-1，生药材均由青岛大学医学院附属医院中草药房提供并鉴定为真品；DMEM培养液（含HEPES 5958 mg·L-1；青霉素 100 IU·mL-1；链霉素 100 μg·mL-1）、无支原体胎牛血清（优级）均由杭州四季青生物工程材料有限公司提供；PBS液、胰蛋白酶、30%过氧化氢（优级纯，国药集团化学制剂有限公司）；超纯水、MTT（青岛福林生物化学有限公司）；95%乙醇（山东酒精总厂药用酒精厂）。

1.3 细胞

神经母细胞瘤（SH-SY5Y）细胞株由瑞典卡洛林斯卡医学院惠赠。

2 方法

2.1 实验药物的制备

将海康灵原方中单味药材（黄芪150 g、制何首乌200 g、红景天100 g、灵芝100 g、党参100 g、川芎60 g、当归60 g）分别按常规中药煎煮方法煎煮2次，合并2次药液浓缩至100 mL，离心除去杂质，加入30%乙醇沉淀12 h，过夜。上清液加热浓缩至56 mL。用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，以原方浓度（浓度单位取mol·L-1）为基准梯度稀释药液（浓度单位取g·mL-1），4 ℃贮藏，备用。

2.2 SH-SY5Y神经细胞的培养

倒置相差显微镜下观察SH-SY5Y细胞贴壁生长均匀，形态呈梭形、多触角形。用含10%胎牛血清的DMEM培养基，置37℃、5%CO2细胞培养箱中进行培养，每3 d传代1次。

2.3 筛选H2O2最佳成模浓度

将SH-SY5Y细胞按每孔5×103个接种至96孔板，细胞生长汇合率达70%～80%时，用含10%胎牛血清DMEM培养液换液，加入不同浓度的H2O2（终浓度分别为0、50、100、130、150、170、200 μmol·L-1，即为空白和H2O2①、②、③、④、⑤、⑥组），每个浓度设定平行的6孔，继续培养24 h，每孔加5 g·L-1MTT20 μL，于37 ℃下、5%CO2保温箱培养4 h，定量吸弃上清液，每孔加入DMSO 150 μL，振荡后用酶标仪进行测定，于测定波长490 nm、参比波长630 nm波长处测定吸光度。以空白组的平均吸光度值为100%，其余各组均与之比较即得细胞存活率（细胞的存活率与其吸光度值呈正比）。

2.4 海康灵原方中单味药材对H2O2损伤SH-SY5Y细胞模型存活率的影响

细胞培养方法同“2.3”项下方法操作，至96孔板细胞生长汇合率达70%～80%时，用含10%胎牛血清DMEM培养液换液，加入不同稀释浓度的单味药材药液（即①、②、③、④组），每个浓度设定平行的3个孔，继续培养24 h。每孔加入20 μL终浓度为150 μmol·L-1的H2O2，继续培养24 h。另设空白、模型组。用MTT法测定细胞的存活率（细胞的存活率与其吸光度值呈正比）。

2.5 新复方与原复方、新复方与单味药对H2O2损伤细胞模型存活率影响的比较

细胞培养方法同“2.3”项下方法操作，至96孔板细胞生长汇合率达70%～80%时，用含10%胎牛血清DMEM培养液换液，分别加入新复方（浓度为0.159 g·mL-1）、原复方（浓度为0.137 g·mL-1）和单味药（黄芪0.268 g·mL-1、制何首乌0.375 g·mL-1、灵芝 0.358 g·mL-1、党参 0.268 g·mL-1、川芎 0.193 g·mL-1、当归0.161 g·mL-1）的药液，每种药液设定平行的3个孔，继续培养 24 h。每孔加入 20 μL 终浓度为 150 μmol·L-1的H2O2，继续培养24 h。用MTT法测定细胞的存活率（细胞的存活率与其吸光度值呈正比）。

2.6 统计学方法

3 结果

3.1 不同浓度H2O2对SH-SY5Y神经细胞活性的影响

SH-SY5Y细胞经H2O2处理后对MTT的摄取能力下降，吸光度值显著低于空白组，表明细胞受到了损伤或部分细胞已经死亡；在50～200 μmol·L-1浓度范围内，随H2O2浓度的增加，细胞的存活率呈梯度下降；与空白组比较，50～130 μmol·L-1组有显著性差异（P＜0.05），150 μmol·L-1以上浓度有极显著性差异（P＜0.01），故选择150 μmol·L-1H2O2作为最佳复制模型浓度。不同H2O2浓度对细胞存活率的影响见表1。

表1 不同H2O2浓度对细胞存活率的影响（±s，n＝6）Tab 1 Influence of Different density of H2O2on cell survival percentage（±s，n＝6）

表1 不同H2O2浓度对细胞存活率的影响（±s，n＝6）Tab 1 Influence of Different density of H2O2on cell survival percentage（±s，n＝6）

与空白组比较：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.blank group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

组别空白组H2O2①组H2O2②组H2O2③组H2O2④组H2O2⑤组H2O2⑥组抑制率/%12.426.236.839.840.846.151.6浓度/μmol·L-1 050100130150170200吸光度值0.876±0.0160.738±0.023＊0.632±0.038＊0.602±0.041＊0.592±0.021＊＊0.539±0.059＊＊0.484±0.037＊＊

3.2 海康灵中不同浓度单味药对H2O2损伤SH-SY5Y细胞存活率的影响

3.2.1 不同浓度黄芪、制何首乌、灵芝、红景天药液对H2O2损伤SH-SY5Y细胞存活率的影响 SH-SY5Y细胞预先用4种不同浓度的黄芪药液、制何首乌药液、灵芝药液、红景天药液孵育24 h，与模型组细胞比较，其测得的吸光度值有所变化。其中，黄芪4种浓度药液处理后，其测得的吸光度值显著增大（P＜0.05），说明这4种浓度的药物对细胞具有明显的保护作用，故选择吸光度值最高的药液浓度（0.268 g·mL-1）为新组方浓度；制何首乌4种浓度药液处理后，其测得的吸光度值显著增大（P＜0.05），说明这4种浓度的药物可明显减轻H2O2对细胞造成的损伤，故选择吸光度值最高的药液浓度（0.375 g·mL-1）；灵芝4种浓度药液处理后，与模型组比较，随浓度的增大，吸光度值也逐渐增大，与其他药物组比较0.358 g·mL-1浓度吸光度值最高（P＜0.05），说明灵芝0.358 g·mL-1浓度比其他浓度药物组对细胞具有更显著的保护作用，故选择0.358 g·mL-1药物组；红景天4种浓度药液处理后，其测得的吸光度值均减小，说明此浓度范围的红景天药液对细胞并无显著的保护作用，故暂不做选择。不同浓度黄芪、何首乌、灵芝、红景天药液对细胞存活率的影响见表2。

表2 不同浓度黄芪、何首乌、灵芝、红景天药液对细胞存活率的影响（±s，n＝3）Tab 2 Influence of different concentrations of the liquids of Astragalus membranaceus，Polygonum multiflorum，Ganoderma，Rhodiola crenulata on survival rate of cells（±s，n＝3）

表2 不同浓度黄芪、何首乌、灵芝、红景天药液对细胞存活率的影响（±s，n＝3）Tab 2 Influence of different concentrations of the liquids of Astragalus membranaceus，Polygonum multiflorum，Ganoderma，Rhodiola crenulata on survival rate of cells（±s，n＝3）

与空白组比较：＊P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05vs.blank group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05

组别空白组模型组黄芪①组黄芪②组黄芪③组黄芪④组灵芝①组灵芝②组灵芝③组灵芝④组何首乌①组何首乌②组何首乌③组何首乌④组红景天①组红景天②组红景天③组红景天④组吸光度值0.7061±0.01030.5524±0.02215＊0.7790±0.03217#0.7224±0.02401#0.7427±0.0309#0.7553±0.0308#0.6381±0.03160.7002±0.01891#0.7395±0.04153#0.7807±0.03402#0.6897±0.071#0.6718±0.027#0.6540±0.0211#0.5611±0.0857#0.4737±0.05500.5494±0.026210.5197±0.043930.4578±0.02336浓度/g·mL-1- -0.2680.4020.4820.5360.1790.2680.3220.3580.3750.5360.6430.7140.1790.2680.3220.358

3.2.2 不同浓度党参、川芎、当归药液对H2O2损伤SH-SY5Y细胞存活率的影响 SH-SY5Y细胞预先用不同浓度的党参药液、川芎药液、当归药液孵育24 h，与模型组细胞比较，其测得的吸光度值有所变化。其中，党参药液处理后，0.268 g·mL-1药物组吸光度值较其他浓度组高，故选择0.268 g·mL-1药物组；川芎4种浓度药液处理后，0.193 g·mL-1药物组吸光度值较其他组高，故选择0.193 g·mL-1药物组；当归4种浓度药液处理后，0.193 g·mL-1药物组吸光度值较其他组高（P＜0.05），故选择0.193 g·mL-1药物组。不同浓度党参、川芎、当归药液对细胞存活率的影响见表3。

表3 不同浓度党参、川芎、当归药液对细胞存活率的影响（±s，n＝3）Tab 3 Influence of different concentrations of the liquids of Codonopsis Radix，Ligusticum chuanxiong，Angelica sinensis on survival rate of cells（±s，n＝3）

表3 不同浓度党参、川芎、当归药液对细胞存活率的影响（±s，n＝3）Tab 3 Influence of different concentrations of the liquids of Codonopsis Radix，Ligusticum chuanxiong，Angelica sinensis on survival rate of cells（±s，n＝3）

与空白组比较：＊P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05vs.blank group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05

吸光度值0.6916±0.051960.4887±0.05802＊0.5803±0.04807#0.5974±0.05444#0.5664±0.038970.4690±0.04290.5479±0.04810.6771±0.0363#0.7146±0.01014#0.6252±0.0797#0.7114±0.022960.7966±0.013060.8566±0.07783##0.8216±0.03522#组别空白组模型组党参①组党参②组党参③组党参④组当归①组当归②组当归③组当归④组川芎①组川芎②组川芎③组川芎④组浓度/g·mL-1- -0.1790.2680.3220.3580.1070.1610.1930.2140.1070.1610.1930.214

3.3 新复方与原复方、新复方与单味药对H2O2损伤细胞模型存活率影响的比较

新复方组的吸光度值明显比原复方组和其他单味药组高（0.7813），说明新复方组比原复方组和其他单味药组对神经细胞更具有保护作用，对受损的神经细胞具有明显的修复作用。新复方与原复方、新复方与单味药对细胞存活率影响的比较见表4。

表4 新复方与原复方、新复方与单味药对细胞存活率影响的比较（±s，n＝3）Tab 4 Comparison of the effects of new formula vs.original one and new formula vs.single ingredient on survival rate of cells（±s，n＝3）

表4 新复方与原复方、新复方与单味药对细胞存活率影响的比较（±s，n＝3）Tab 4 Comparison of the effects of new formula vs.original one and new formula vs.single ingredient on survival rate of cells（±s，n＝3）

与空白组比较：＊P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05vs.blank group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05

组别空白组模型组新复方组原复方组黄芪组制何首乌组灵芝组党参组川芎组当归组吸光度值0.6338±0.01530.4883±0.0084＊0.7813±0.02509#0.6328±0.02473#0.6211±0.0236#0.4926±0.024050.6913±0.0403#0.4938±0.02960.6094±0.03813#0.5658±0.0774#浓度/g·mL-1- -0.1590.1370.2680.3750.3580.2680.1930.161

4 讨论

AD是一种中枢神经系统退行性疾病，临床主要表现为认知功能障碍、行为异常及日常生活能力下降，主要神经病理改变有神经元变性、丢失引起的脑萎缩，细胞外的老年斑（Senile plaque，SP）和细胞内的神经元纤维缠结（Neurofibrillary tangle，NFT）[2，3]。近年来越来越多的证据显示，多种神经退行性病变与氧化应激密切相关[4]。

目前，大量的相关实验证实，在治疗老年性痴呆的各类药物中，中药复方因其具有疗效好、副作用少、兼顾面广、能长期服用等优势，越来越受到人们的重视。本次实验在前期研究的原有复方的基础上，为进一步研究其作用机制，筛选出较为理想的量效关系，进行了拆方后重新组方的研究，采用体外神经细胞（SH-SY5Y）培养，MTT比色分析的方法进行。研究发现，SH-SY5Y细胞预先用0.268 g·mL-1浓度的黄芪药液、0.375 g·mL-1浓度的制何首乌药液、0.358 g·mL-1的灵芝药液、0.268 g·mL-1浓度的党参药液、0.193 g·mL-1浓度的川芎药液和0.193 g·mL-1浓度的当归药液孵育后，能有效拮抗H2O2造成的细胞损伤（P＜0.05），细胞存活率显著升高。

原方拆方后，筛出的浓度剂量更加合理：黄芪0.268 g·mL-1、制何首乌0.375 g·mL-1、灵芝0.358 g·mL-1（原方为0.179 g·mL-1）、党参0.268 g·mL-1（原方为0.179 g·mL-1）、川芎0.193 g·mL-1（原方为 0.107 g·mL-1）、当归 0.193 g·mL-1（原方为0.107 g·mL-1）、红景天不做选择。依照此浓度剂量重新组成的复方与原复方和单味药的最佳浓度剂量组对神经细胞的作用比较，新复方具有明显的优势，进一步说明单味中药在治疗中是有局限性的，中药复方是中医辩证论治、理法方药等理论的具体体现。中药复方的应用，既不是药物作用在数量上的简单相加，也不是毒副反应相互间机械地抵销，而是通过药物合理配伍产生出整体综合效应，符合传统中医药理论和多组分、多靶点、多效应的现代理论[5]。与单纯的化合物比较，中药在AD的防治方面具有更大的潜力[6]。

总之，本次拆方研究为下一步的临床应用提供了理论依据，优化后的处方将会应用于临床来验证其疗效。

[1]张 艳，陶根鱼.Alzheimer’s病病因学及发病机制的研究进展[J].陕西中医函授，2001，3：40.

[2]Ricardo B，Maccionil，Cristobal B，et al.Biological markers of Alzheimer’s disease and mild cog-nitive impairment[J].Current Alzheimer Research，2004，16（1）：307.

[3]Nirvana S，Girish J.Molecular mechanisms，emerging etiological insights and models to test potential therapeutic interventions in Alzheimer’s disease[J].Current Alzheimer Research，2004，16（1）：295.

[4]张均田.老年痴呆的发病机制及治疗策略EJ-1[J].药学学报，2000，35（5）：368.

[5]罗国安，王义明.中药复方物质基础和药效相关性研究[J].世界科学技术-中药现代化，1999，1（1）：11.

[6]朱海升，刘鄂湖.抗老年性痴呆的天然药物研究进展[J].中国药房，2007，18（3）：225.