银杏叶提取物对老年大鼠术后认知障碍的防治作用

鹿洪秀，苏 帆，马德东

由于老年人术后认知功能障碍（postoperative cognitive dysfunction，POCD）的发病机制尚未完全研究清楚，目前还没有有效的防治措施，只能从引起POCD的相关因素着手，在围术期予以妥善处理，达到预防目的[1-2]。本研究通过老年大鼠POCD模型，观察银杏叶提取物对POCD的防治作用。为观察影响大鼠认知功能改变的可能因素，我们采用了旷场分析实验和血氧水平依赖（blood oxygen level dependent，BOLD）磁共振显像进行比较。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级健康雄性Wistar大鼠，≥20月龄，体质量300～500g，由山东大学实验动物中心提供。实验动物合格证号010153。

1.2 药物及主要仪器 1%戊巴比妥钠，购自上海西唐生物公司。银杏叶提取物注射液，5mL含总黄酮醇甙4.2mg，银杏内酯A 0.30mg，北京双鹤药业有限公司生产。3.0T MRI显像系统为美国GE公司制造。

1.3 方法

1.3.1 模型制备 腹腔注射无菌1%戊巴比妥钠40mg/kg，动物呼吸变深变慢，四肢肌肉软弱无力，角膜反射迟钝，说明已处于麻醉状态。局部消毒，行左侧股动脉穿刺，插入含1%肝素钠的导管，接三通管。连接多功能监护仪，持续监测血压、心率。剃去腹部毛发，消毒，行腹正中切口，长约4cm。按照肠管、肝、脾、肾脏次序作腹腔探查，完成后按照同样顺序重复探查，维持4 h。术中严格无菌操作，肠管等脏器牵拉至腹腔外时用无菌生理盐水纱布覆盖。至大鼠略苏醒，追加1/3量戊巴比妥钠，维持麻醉和手术4 h。术中耳缘静脉输注生理盐水，术毕用0号线缝合切口，无菌纱布覆盖，苏醒后放入笼中。术中予腹腔加温生理盐水滴注保持肛温在37.5℃。麻醉过程中动物有时因呼吸道分泌物过多影响呼吸，可将动物舌头拉出口腔，保持动物呼吸通畅。术后常规腹腔注射青霉素钠，以防并发感染。

1.3.2 分组及治疗 随机将动物分为实验组(A组和B组)和空白对照组（C）。实验组共30只，按上述方法行腹腔探查维持4 h；其中15只自术前1周开始给予银杏叶注射液0.5mL腹腔注射,1次/d，为治疗组(A组)；15只探查同时给予等量的生理盐水作为对照（B组）；空白对照组15只（C组），仅腹腔注射同等容量的无菌生理盐水，每日1次，不做腹腔探查。

1.3.3 学习记忆功能检测 实验鼠于上午8:00～11:00对其进行Y型迷宫实验(实验在安静、光线较暗的环境中进行)，Y型迷宫内设起步区、电击区和安全区，先将大鼠放入迷宫箱内适应5min。大鼠能从起步区(在5 s内)直接逃避至安全区为正确，否则为错误反应。每测1次休息30 s，测定10次休息5min，达到学会的标准为连续10次测试中有9次为正确。记录每只大鼠达到学会标准前所需的训练次数(剔除反应敏捷的大鼠)，48 h后再次测试10次，其中正确反应所占比例为大鼠的记忆成绩。麻醉手术前后均进行测试。

1.3.4 旷场分析试验检测 旷场分析箱高40cm，长和宽均为80cm，周壁为黑色，底面为面积相等的25块方格，沿墙壁称外周格，其余为中央格，将大鼠放入旷场反应箱正中格中，观察3min内大鼠的活动情况。采用单盲法，设2位观察者，分别观察不同指标包括大鼠理毛次数，中央格内停留时间，跨格次数(3爪以上跨入邻格的次数)和站立次数(两前肢离地 1cm以上)。每次测试后，清洗旷场周壁及底面，以免上次动物余留的信息影响下次测试结果，测试时机也是在麻醉手术前后进行。实验时间为每天上午8:00～12:00，麻醉手术后第 1 d进行旷场分析试验，并记录成绩。

1.3.5 MRI扫描 老年大鼠给戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后进行BOLD成像。首先扫描轴位、冠状位及矢状位的T2加权图像，了解大脑及周围解剖结构；选取脑组织最大截面方向进行BOLD扫描。以不同TE值（20～140 ms，间隔20 ms）扫描一系列GRE序列图像，用以计算R2*值（BOLD信号强度）。

1.3.6 数据分析 所有数据在GE工作站作初步处理，观察灌注显像图，导出Dicom格式原始数据，将Dicom数据导入IDL6.0中采用自定义参数及语句按每像素计算R2*值。对lnS(t)及TE值进行最小方差法直线拟合，该直线的斜率即是-R2*值（单位是s-1）。

2 结果

2.1 迷宫记忆功能成绩 实验结果表明A组动物的记忆功能在术前、术后未见明显改变，但B组记忆功能显著低于C组，旷场试验成绩亦明显降低（表1）。

表1 大鼠迷宫记忆功能成绩()

表1 大鼠迷宫记忆功能成绩()

注:与术前比较，*P＜0.05；与B组比较，$P＜0.05

组别A组B组C组n 151515术前9.10±1.229.00±0.899.03±1.06术后1天8.68±1.30$6.89±0.76*9.11±0.87$

2.2 MRI BOLD氧水平 MRI T2加权图像显像结果如图1所示，用以显示解剖结构；图2为不同TE值颅内信号强度变化。该显像原始DICOM数据导入IDL内计算每个象素的参数，并用于BOLD的计算。不同TE值下信号强度自然对数图的拟合直线的斜率为-R2*。R2*即反映了乏氧的程度:乏氧越严重，R2*值越大，反之越小。三组大鼠BOLD结果显示，B组大脑R2*平均值明显高于A组大鼠（P＜0.05），C组虽然也高于A组，但无统计学意义，且显著低于B组（P＜0.05，表2）。

图1 实验大鼠颅脑矢状位T2加权图像

表2 大鼠BOLD显像R2*结果比较()

表2 大鼠BOLD显像R2*结果比较()

注:与A组比较，*P＜0.05；与B组比较，#P＜0.05

组别A组B组C组n 151515 R2*（s-1）8.9±5.5629.0±3.40*13.2±8.16#

图2 大鼠颅脑不同TE值冠状位T2*图像

2.3 MRI BOLD氧水平检测对记忆功能的关系 记忆功能评分与BOLD结果相关性分析显示，二者相关系数r=-0.824，P＜0.05，高供氧代谢状态可以预测较好的认知功能。

2.4 银杏叶提取物对老年大鼠POCD的防治作用 A组与B组相比，术后认知评分明显改善（P＜0.05，表1），较术前虽有降低但无统计学差异。旷场试验分析，各项指标A组较B组均有明显改善（P＜0.05，表3）。

表3 大鼠旷场分析试验检测结果()

表3 大鼠旷场分析试验检测结果()

注:与术前比较，*P＜0.05；与A组比较，$P＜0.05；与B组比较，#P＜0.05

组别A组B组C组n 术前（3min）术后1天（3min）151515理毛次数(次)2.5±1.22.3±1.52.6±1.1中央格时间（s）2.9±1.92.5±1.22.6±1.4夸格次数(次)25.3±16.523.9±14.522.7±15.9站立次数(次)7.0±4.67.9±6.56.7±7.9理毛次数(次)2.1±1.61.2±1.0*$2.2±1.7#中央格时间（s）3.2±1.54.0±1.1*2.3±1.9#夸格次数(次)22.3±14.212.1±15.1*$19.6±20.4#站立次数(次)6.3±3.63.2±2.9*$5.5±27#

3 讨论

我国面临日益严重的人口老龄化问题，而且老年人面临麻醉和手术的机会较多，术后可能会发生POCD。老年人一旦发生POCD，除自己的独立生活能力下降外，还对社会造成沉重的负担[3]，预防其发生比治疗具有更重要的意义。目前对POCD尚没有令人满意的防治方法，因此通过POCD动物模型探索中药的防治作用有着重要意义。

动物模型中常用的认知功能检测方法包括旷场分析试验和迷宫试验。旷场分析试验主要反映动物对新环境的探究[4]、习惯以及伴随的情绪变化。中央格停留时间是动物空间认知能力的反映，正常动物会避开空旷环境，迅速离开中央格，沿周边活动[5]。如果对新环境的认知能力差，则大鼠停留在中央格的时间就会延长。站立行为和站立次数是动物探索行为及兴奋性的反映，认知较差的大鼠探索行为下降，兴奋性显著降低，对新环境的适应性比正常动物差。理毛是动物对新环境满意程度的反映，理毛时间延长，反映对新环境的适应能力强。也与动物的兴奋性有关，在恐惧、紧张及不安时常表现出的一种行为。过去人们在研究中发现，当动物处于恐惧状态时，这一行为有加强的趋势。认知是个复杂的脑功能活动，本课题通过脑功能成像技术，在整体水平探索全麻药物对大脑的作用机制，以立体三维空间图像对麻醉过程中及术后脑认知功能进行活体、微区、瞬间、动态、无损伤研究，从而为预防、诊断探索一条新的方法，为治疗POCD提供新的新的理论依据。

中药制剂银杏叶提取物国内外均有报道，对大脑及血脑屏障有保护作用，并对脑代谢和神经递质有一定影响。银杏叶提取物能够降低血黏度，降低血小板聚集性，帮助血液更顺利地通过最为细小和狭窄的血管，使大脑、心脏和四肢的组织中缺氧的部分获得营养。最重要的是，银杏不仅能够将氧气和血液更多地输送到健康部分，而且是一种高效的抗氧化物，能有效清除自由基、防止高脂肪细胞膜被氧化。因此，银杏叶能够改善临床症状和神经功能缺损，具有增强中枢胆碱能功能，改善心脑循环的作用，有利于脑缺血性损伤与记忆等功能的恢复，对改善老年记忆功能起到有益的作用。有研究发现[6-7]，银杏叶制剂可以预防老年性POCD。本研究中，银杏叶组防治大鼠认知功能障碍各项指标，与空白对照组相比均有改善，差异有统计学意义，治疗期间未发现有明显副作用。

本研究首次活体观察了银杏叶提取物对POCD模型脑组织供氧的影响，证实了其改善脑组织供氧水平的功能，并且这种供氧的改善与认知功能密切相关。据此我们认为，其机制可能与改善脑组织血氧水平有关。本研究只对术后第1天发生POCD的情况进行观察，今后可进一步延长观察时间。银杏提取物作为一种有应用前景的预防POCD的药物，可尝试在临床试用。

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