盐酸洛美沙星大鼠在体肠吸收动力学研究

郑雪静，赵庆春 ，颜 鸣，郑永昌，程 刚

盐酸洛美沙星为第三代喹喏酮类广谱抗菌药物，该药抗菌活性强，对革兰阳性菌的抗菌活性与诺氟沙星相同，强于依诺沙星;对革兰阴性菌的作用与依诺沙星相同，毒性低，广泛用于治疗敏感细菌引起的呼吸道、泌尿生殖系统、胃肠道、皮肤软组织等感染。由于大鼠肠道吸收特点与人体吸收的相关性已经由许多实验得到证实，为探讨盐酸洛美沙星在不同肠段的吸收特征，指导口服类剂型的设计，本文采用大鼠在体肠吸收试验方法［1］，对盐酸洛美沙星的吸收部位和吸收动力学进行研究，希望对剂型设计提供可靠的生物药剂学依据。

1 实验材料

Waters501高效液相色谱仪(美国Waters公司);UV-2501PC紫外分光光度计(岛津);Sartorius普及型pH计(pB-10)，德国赛多利斯股份有限公司);离心机:TBL-16B高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂);AUW120D岛津分析天平;DK-98-1型电热恒温水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司);恒流泵:EYELA CERAMIC PUMP VSP-3050(VSP-3050型中压柱层析，日本东京理化株式会社)。盐酸洛美沙星(南通林港有限公司);酚红(天津市博迪化工有限公司);乌拉坦(中国医药集团上海化学试剂公司);Kreb-Ringer's营养液［2］(简称 K氏液，自配，每1 000 mL内含有 NaCl 7.80 g;KCl 0.35 g;NaHCO31.37 g;NaH2PO40.32 g，MgCl20.02 g，葡萄糖 1.40 g);其他试剂均为分析纯。雄性Wister大鼠，体质量(250±20)g(沈阳药科大学实验动物中心，合格证号:辽实动质字2003-008)。

2 方法

2.1 肠循环液中酚红的浓度测定

2.1.1 酚红标准曲线的建立 精密吸取Kreb-Ringer's营养液，配制含酚红浓度为10、20、30、40、50 μg/mL系列标准液，分别吸取0.5 mL加入0.2 mol/L NaOH溶液5 mL显色，在波长558 nm处，以0.2 mol/L NaOH为空白对照，测定吸收度A值。以吸收度A对酚红浓度C做线性回归，得标准曲线方程:A=0.017 6 C+0.014 8，R2=0.999 6。

2.1.2 肠循环液中酚红浓度的测定 取大鼠在体肠循环液在不同时间点的样品，分别吸取0.5 mL，加入0.2 mol/L NaOH溶液5 mL显色，以0.2 mol/L NaOH为空白，在558 nm处测定吸光度A，代入标准曲线方程求得酚红浓度。

2.2 肠循环液中盐酸洛美沙星浓度的测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱:DiamonsilTMC18(200 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相:0.02 mol/L磷酸溶液(用三乙胺调节pH至2.6)∶乙腈(体积比 85∶15)检测波长:287 nm;进样量:20 μL;流速:1 mL/min;柱温:室温。分别取空白肠循环液(即加入酚红K氏液进行大鼠小肠循环灌注2 h)、盐酸洛美沙星对照液及样品溶液(肠循环液)，按“2.2.1”色谱条件下测定。结果表明，盐酸洛美沙星保留时间约为12 min，样品液的主峰保留时间与对照液一致，空白肠循环液对测定无干扰。

2.2.2 标准曲线的制备 精密称取盐酸洛美沙星贮备液适量，用含有酚红20 μg/mL的K氏液稀释含盐酸洛美沙星浓度为 20、30、50、100、150、200 μg/mL系列的盐酸洛美沙星溶液，在上述色谱条件下，以峰面积A对浓度C进行线性回归，得标准曲线方程:A=2.298 7×104C－105 23，r=0.999 6(n=6)。

2.2.3 肠循环液中盐酸洛美沙星的浓度测定在不同时间点取大鼠在体肠循环液样品续滤液20 μL，注入高效液相色谱仪，代入“2.2.2”项下标准曲线，计算盐酸洛美沙星的浓度。

2.3 大鼠在体肠循环液实验

2.3.1 供试液的配制 精密称取酚红20 mg于1 000 mL量瓶中，用K氏液溶解并定容，得空白肠循环液。称取盐酸洛美沙星约100 mg于1 000 mL上述肠循环液中，充分搅拌使药物溶解，过0.45 μm的微孔滤膜，避光冷藏作为贮备液。将贮备液以空白肠循环液稀释一定倍数，吸取20 μL进行液相色谱分析，测定药物峰面积，代入“2.2.2”项下标准曲线方程，计算贮备液中药物浓度。在肠吸收实验之前，根据测定结果量取适量贮备液，以空白肠循环液配制成不同浓度以及不同pH值的盐酸洛美沙星供试液。

2.3.2 肠吸收试验方法［3］选择实验前禁食12 h(不禁水)的大鼠，腹腔注射20%乌拉坦溶液(1.0 g/kg)麻醉后固定。沿腹中线切开腹腔，在实验肠段两端各切一小口，在上下两端小口处各插入玻璃管，并用手术线固定。用37℃生理盐水缓缓注入肠管，洗净肠段内容物。用硅胶管将肠段两端的玻璃管与蠕动泵及供试液连接，形成回路，开动蠕动泵。取预热的37℃供试液200 mL，先以5 mL/min流速循环10 min后，将流速调节为2.5 mL/min进行回流，于回流 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h 取回流液2 mL，同时补充等量的空白肠循环液。样品经0.45 μm微孔滤膜过滤，弃去初滤液，取续滤液0.5 mL，用紫外分光光度法测定酚红浓度，取20 μL用于高效液相分析，测定盐酸洛美沙星的浓度。分别考察各肠段区间如下:十二指肠段自幽门1 cm处开始;空肠距幽门15 cm处开始;回肠段自盲肠上行20 cm处开始;结肠段从盲肠后段开始;肠段区间均取10 cm。整肠段自十二指肠上端起到回肠下端止。

2.3.3 盐酸洛美沙星在肠循环液中稳定性考察

取20 mL盐酸洛美沙星供试液于循环装置中，在同样实验条件下循环，分别在0、1、2、3、4 h取样，按照“2.2.2”项下操作测定盐酸洛美沙星的在肠循环液中含量变化。

3 结果

3.1 肠循环液中药物浓度的方法学结果 酚红测定方法的回收率和精密度:酚红低、中、高3个浓度(10、20、30 μg/mL)，平均回收率为 99.82%、99.39%、100.22%(n=5)，精密度 RSD分别为0.18%、0.33%、0.29%(n=5)。

盐酸洛美沙星测定方法的回收率和精密度:盐酸洛美沙星低、中、高 3个浓度(1.5、15、150 μg/mL)，平均回收率为 98.93%、99.20%、100.10%(n=5);精密度 RSD分别为0.28%、0.35%、0.13%(n=5);日内精密度 RSD为0.38%、0.45%、0.36%(n=5);日间精密度RSD为0.42%、035%、0.46%(n=5)。结果表明，测定方法回收率和精密度均符合要求，证明该方法适用于药物含量测定。

3.2 盐酸洛美沙星在肠循环液中稳定性 盐酸洛美沙星在肠循环液中含量没有明显变化，稳定性良好(RSD=1.15%)。

3.3 在体肠吸收动力学研究结果及影响因素

3.3.1 数据处理方法［4］吸收百分率:通过测定吸收前后供试液中药物浓度的变化，计算药物总的减少值，以求得小肠对药物的吸收量。由于小肠对药物吸收的同时也吸收水分，因此，供试液中加入不被吸收的酚红，根据酚红的浓度可以矫正供试液体积的变化，以便准确求出药物总量的变化。药物吸收百分率按以下公式进行计算:

式中:C0:原供试液中药物的浓度(μg/mL);V0:原供试液体积(mL);C0':原供试液中酚红的浓度(μg/mL);C1':回流4 h后循环液中酚红的浓度(μg/mL);C1:回流4 h后循环液中药物的浓度(μg/mL)。

吸收百分数速率常数:以每一时刻循环液中剩余药量均值的对数对时间做图，得一条直线，说明药物吸收为表观一级速度过程。可按以下公式计算:

式中:lnX和lnX0分别表示循环液中剩余药量和原供试液中药量的对数值，Ka表示吸收速率常数，t表示时间。

3.3.2 各肠段吸收速率常数及吸收百分数 见表1。配制20 μg/mL供试液，分别在十二指肠、空肠、回肠和结肠回流4 h，并于规定时间取样。以各取样点剩余药量取对数值对时间做图，根据斜率求出各肠段吸收速率常数Ka，并求得回流4 h的吸收百分数。结果见表1。可知，十二指肠、空肠、回肠和结肠的吸收速率常数和吸收百分率差异有统计学意义，并按照空肠＞十二指肠＞回肠＞结肠的顺序依次降低。

表1 盐酸洛美沙星在大鼠各肠段的吸收速率常数及吸收百分数(±s，n=5)

表1 盐酸洛美沙星在大鼠各肠段的吸收速率常数及吸收百分数(±s，n=5)

部位 吸收(%) Ka(h－1)十二指肠20.2 0.204 5±0.034 4空肠 23.3 0.321 0±0.045 8回肠 16.3 0.183 9±0.038 2结肠12.4 0.129 2±0.045 3

3.3.3 不同药物浓度对肠吸收的影响 见表2。

表2 不同浓度盐酸洛美沙星的肠吸收速率常数及吸收百分数(±s，n=5)

表2 不同浓度盐酸洛美沙星的肠吸收速率常数及吸收百分数(±s，n=5)

浓度(μg/mL) 吸收(%) Ka(h－1)1.5 20.28±2.810 0.192 7±0.091 2 15.0 24.27±2.919 0.219 2±0.032 1 150.0 28.22±3.190 0.230 9±0.048 2

由表2可知，在1.5～150 μg/mL内药物的吸收量和质量浓度线性关系良好，吸收速率常数几乎保持不变，表明药物吸收是被动扩散的结果。

3.3.4 不同pH值对肠吸收的影响 见表3。由表3可知，对不同pH值条件下吸收速率常数进行方差分析，结果表明，溶液的pH值对小肠吸收基本无影响。

表3 不同pH值下盐酸洛美沙星的肠吸收速率常数及吸收百分数(±s，n=5)

表3 不同pH值下盐酸洛美沙星的肠吸收速率常数及吸收百分数(±s，n=5)

pH值 吸收(%) Ka(h－1)6.29 20.23±2.181 0.163 1±0.029 2 6.79 22.21±2.902 0.181 9±0.023 1 7.40 18.29±1.931 0.160 2±0.031 1

4 讨论

4.1 药物浓度测定方法的选择 采用在体肠吸收实验来研究盐酸洛美沙星在大鼠肠道内的吸收动力学特征，方法简便、快捷，不损伤大鼠的血管及神经，可以有效模拟药物在肠道不同部位的吸收情况。由于酚红不被肠壁所吸收，可以用来测定小肠对水分的吸收，进而计算肠循环液中药物浓度的变化。本实验中药物浓度的测定采用高效液相色谱法，与常规的双波长法比较，测定结果准确、可靠。

4.2 药物的吸收机制 本实验结果表明，药物浓度及pH值对药物吸收几乎无影响，小肠吸收速率常数间差异无统计学意义，所以盐酸洛美沙星的大鼠肠吸收属于一级动力学过程［5］，吸收机制为被动扩散。但是各肠段之间的吸收差异有统计学意义，药物在全小肠段的吸收良好，而在结肠段的吸收较差，从而为盐酸洛美沙星的剂型设计奠定基础。

4.3 实验结果对剂型设计的指导意义 胃肠道吸收机制的研究是处方前的重要工作，能够指导人们根据药物的吸收机制和吸收部位特点选择合适的剂型，保证和提高药物制剂的生物利用度，从而减少剂型设计的盲目性。本实验中盐酸洛美沙星在大鼠全肠段均有吸收，吸收符合一级动力学特征，吸收机制为被动转运。

［1］ 梁桂贤.药物肠吸收研究方法近况［J］.山西职工医学院学报，1997，7(2):57-59.

［2］ 毛凤斐，屠锡德，朱家璧，等.黄芩甙大鼠小肠吸收的研究［J］.南京药学院学报，1984，15(1):61-63.

［3］ 平其能.药剂学实验与指导方针［M］.北京:中国医药科技出版社，1994:214-218.

［4］ 陶秀梅，唐星.利巴韦林大鼠肠吸收动力学［J］.沈阳药科大学学报，2004，21(6):401-404.

［5］ 宋洪涛，谢彤，唐鲁平，等.川芎嗪大鼠在体肠吸收动力学［J］.中国医院药学杂志，2005，25(10):905-907.